Protokolümüz, genel olarak proteinlerin değil, proteinlerin de bulunduğu FAH etki alanının etkin bir şekilde ifade edilebilmektedir. FHD protein-1 TCA döngüsü ve mitokondri enerji metabolizmasında düzenleyici bir rol oynar. FHD-1 downregülasyonunu hücresel senescence ile ilişkilendirebildik ve gözlenen fenotiplerin arkasındaki moleküler mekanizmaları anlamak için genellikle enzim aktivitesi ve protein yapısı hakkında bilgi gerekiyor.
IPTG indüklenek vektör sistemleri ile proteinleri ifade etmenin en büyük avantajı, tüm yöntemlerin nispeten ucuz ve herhangi bir laboratuvarda kurulması kolay olmasıdır. Nikel NTA agarose resinler ile birlikte poli-histidin tip proteinler kullanılarak, afinite kromatografisinin muazzam seçiciliği düşük maliyetle kullanılabilir. Çoğu amaç için, bu kalitede elde edilen protein zaten yeterli olabilir.
Diğer ellerde FPLC, diğer yöntemlere göre çeşitli avantajları ile iyi kurulmuş ve genel bir yöntemdir. İlk olarak, buz üzerinde 100 mikrolitre ptik BL21-DE3 pLysS E.coli bakterisine 5 ila 10 nanogram plazmid yerleştirin. İçeriği karıştırmak için tüpü hafifçe titretin.
Bakterileri 30 dakika buzda tutun, birkaç dakikada bir tüpe hafifçe vurun. Bir termoshake'i 42 dereceye ısıtın. Bakteri içeren tüpü 90 saniye boyunca aparata ve ısıya yerleştirin.
Sonra, hemen buz üzerine tüp yerleştirin. Buz üzerinde beş ila 10 dakika sonra, NZCYM orta 600 mikrolitre ekleyin ve bir bakteri kuvöz içine tüp yerleştirin. Bir saat boyunca 37 santigrat derece sallayarak yönü boyunca orta hızda tüp çalkalayın.
Kuluçka dan sonra, 10 santimetre LB agar plaka üzerinde bakteri kültürünün plaka 200 mikrolitre seçim antibiyotikseçimi içeren. Kültür LB agar plaka üzerinde bakteri kuvöz de bakteri kuvöz üzerinde bakteri 37 santigrat bir gecede. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin ve seçilen antibiyotikler ile NZCYM beş mililitre içinde dağıtmak.
Bir gecede 37 derecede bakteri kuvözde kültür. Başarılı bakteri büyüme sonra, protein miktarı talebine bağlı olarak 250 mililitre, 500 mililitre veya orta bir litre toplu bakterileri yükseltmek. Sonra, kültür bakteriler, bakteri kuvözde 37 santigrat derecede 2-3 saat.
Kuluçkadan sonra fotometrik analiz için bir örnek çizin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.4'e ulaştıysa, 200 mikromolar bir milimolar kadar izopropil-beta-D-tiogalactopyranosid uygulayın. 37 santigrat derece de bakteri kuluçka üç ila beş saat sonra protein ifadesi tükenmiştir.
Beş dakika için 5, 000 kez G santrifüj ile bakteriyel pelet hasat. Sonra, supernatant atın ve kısa depolama için eksi 20 derece santigrat pelet dondurun. Orijinal bakteriyel süspansiyon her 250 mililitre için, bakteriyel pelet için seçilen tampon beş mililitre uygulayın.
Uygulanan tampon beş mililitre başına beta-mercaptoethanol 10 mikrolitre ekleyin. 10 mililitrelik Pasteur pipetkullanarak peleti çizilmeye ve boruhaline getirerek süspansiyona mekanik olarak zorlayın. Tüm süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
O zaman süspansiyonu sonicate edin. Sonra, santrifüj 4 santigrat derecede yüksek hızda 30 dakika. Supernatant'ı buz üzerindeki filtre üniteleriyle art arda filtreleyin.
Boş bir plastik veya cam kolon kararlı bir tutucuya takarak ve nikel NTA çalışan tampon ile yıkama hazırlayın. Protein süspansiyon her 10 mililitre için kolona nikel NTA agarose bulamaç 500 mikrolitre uygulayın. Sütunu, agarose reçinesini bozmamak ve arabelleğin yerçekimi tarafından çalışmasını sağlamak için nikel NTA çalışan tampon ile tamamen doldurun.
Daha sonra, protein süspansiyonu kolona uygulayın ve numunenin yerçekimi ile çalışmasını bekleyin. Örnek geçtikten sonra, sütunu nikel NTA çalışan arabellek ile doldurun. Sütunun altına UV saydam bir cuvette yerleştirin ve bir mililitre nikel NTA elüsyon tamponu toplayın.
Boş bir örneğe karşı 280 nanometredeki numunenin optik yoğunluğunu kontrol edin. En iyi şekilde, örnek 2,5'ten büyük bir optik yoğunluk görüntüler. FAHD proteinleri ve nikel NTA elüsasyon tamponu donma ve erime üzerine çökelteceği için, 100 mililitre diyaliz tamponu başına bir mikrolitre DTT kullanarak bir mikrolitre dtt kullanarak bir gecede buz üzerinde farklı bir tampona karşı protein diyaliz.
Bir FPLC sistemi ayarlayın ve beş sütun hacmi %20 etanol ile birlikte beş sütun hacmi ve ardından beş sütun hacmi su ile yıkayın. Sütunu dengeledikten sonra, diyaliz ekibi sütuna uygulayın ve akışı toplayın. Bir degrade elution ayarlayın.
Degrade bittikten sonra, bir sütun hacmiaralığında daha fazla tepe algılanmayana kadar yüksek tuz arabelleğiyle çalıştırın. Bir mikro plaka okuyucu başlatın ve 25 derece santigrat 30 dakika için denge. Enzim test tamponu test edilecek bir substrat 20 milimolar çözelti bir mililitre hazırlayın.
Metin protokolündeki pipetleme şemasına göre, 90 mikrolitre enzim test tamponu ile kuyulara beş mikrolitre enzim çözeltisi ile pipetleme yaparak enzim boş ve örnek kuyularını hazırlayın. Daha sonra 95 mikrolitre enzim test tamponu borularını kuyulara aktararak substrat boş ve örnek kuyuları hazırlayın. Ölçümden hemen önce, altı boş kuyuya beş mikrolitre enzim sayan arabellek uygulayın.
Numune kuyularına 20 milimolar substrat çözeltisinin beş mikrolitresini uygulayın. Kuyuları hafifçe karıştırmak için 50 mikrolitre ayarında çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra plakayı mikro plaka okuyucuya takın ve her kuyuyu 255 nanometrede ölçün.
Son olarak, bir elektronik tabloda çözümleme gerçekleştirin. Optimal ve optimal olmayan dönüşümden sonra lb agar plakaları iki örnek burada gösterilmiştir. Çok fazla bakteri kolonisi ya iki bakteri nin kaplandığını ya da antibiyotiklerin süresinin dolabileceğini gösterir.
Çok az bakteri kolonisi dönüşüm için yeterli plazmid in kullanılmadığını ya da bakterileri seçmek için çok fazla antibiyotik kullanıldığını gösterebilir. Miligram miktarlarda ifade edilen proteiniçeren bakteriyel pelet hasat edilir ve ifade SDS sayfası üzerinden doğrulanır. Bu basit işlem sırasında bazı sorunlar oluşabilir, dahil olmak üzere proteinler inkiştirme organları oluşturan veya protein ifade edilmemektedir dahil.
Proteini etiketlemek için His-tag kullanılırsa, nikel NTA agarose ile afinite kromatografikontaminasyonların çoğunu ortadan kaldıran kolay ve ucuz bir yakalama yöntemidir. Etiket kullanılmazsa, amonyum sülfat çökelti ve ardışık hidrofobik değişim kromatografisi kombinasyonu da proteini diğer proteinlerin çoğundan ayırabilir. Protein, iyon değişimi kromatografisi ve yeterince saf bir protein elde etmek için boyut dışlama kromatografisi ile artık kontaminasyonlardan daha da ayrılır.
Açıklanan yöntemlerin hiçbiri özellikle zordur. Ama tüm yöntemler eğitim gerektirir. İlk denemeler başarısız olabilir, ancak bazı ek uyarlamalardan sonra denemeler başarılı olur.
Burada sunulan tüm yöntemler protein arınması için genel yöntemlerdir. FAHD proteinleri için özel leştirilmiş olmasına rağmen, protokol arındırmak istediğiniz herhangi bir proteine uyarlanabilir. Rekombinant insan FAHD-1 açıklanan yöntemler le elde edilmiş ve yüksek çözünürlüklü x-Ray yapıları hem dekarboksilaz hem de hidrolaz gibi davranan işlevsellik ile FAHD-1 anlayışımıza büyük katkı larda bulunmuştur.
Bu çalışmada kullanılan bakteriler güvenlik suşları ve tehlikeli değildir. Tüm kimyasallar için genel güvenlik kılavuzları uygulanmalıdır ve FPLC kolonları özenle kullanılmalıdır.
