당사의 프로토콜은 단백질뿐만 아니라 일반적으로 단백질을 함유한 FAH 도메인의 효율적인 발현 및 정제 방법을 설명합니다. FHD 단백질-1은 미토콘드리아의 TCA 주기 및 에너지 대사에 있는 규제 역할을 합니다. 우리는 세포 노화에 FHD-1 다운 조절을 연결할 수 있었고 효소 활성 및 단백질 구조에 대한 정보는 일반적으로 관찰 된 표현형 뒤에 분자 메커니즘을 이해하기 위해 요구된다.
IPTG 유도 벡터 시스템을 통해 단백질을 표현하는 주요 장점은 모든 방법이 모든 실험실에서 비교적 저렴하고 쉽게 설정할 수 있다는 것입니다. 니켈 NTA 아가로즈 수지와 함께 폴리 히스티딘 형 단백질을 사용함으로써, 친화도 크로마토그래피의 엄청난 선택성은 저렴한 비용으로 사용될 수 있다. 대부분의 목적을 위해, 이 질에서 얻은 단백질은 이미 충분할 지도 모릅니다.
다른 손에 FPLC는 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 가진 잘 확립되고 일반적인 방법입니다. 먼저, 얼음에 유능한 BL21-DE3 플라이스 E.coli 박테리아의 100 마이크로리터에 5-10 나노그램의 플라스미드를 삽입합니다. 내용을 혼합하기 위해 튜브를 약간 누릅니다.
박테리아를 얼음에 30분 간 유지하여 몇 분마다 튜브를 부드럽게 두드십시오. 온도 가루를 섭씨 42도로 가열합니다. 박테리아가 함유된 튜브를 장치에 넣고 90초 동안 가열합니다.
그런 다음 튜브를 얼음 위에 즉시 놓습니다. 얼음에 5-10 분 후, NZCYM 배지의 600 마이크로 리터를 추가하고 박테리아 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 흔들리는 방향을 따라 중간 속도로 튜브를 흔들어.
배양 후, 선택 항생제를 포함하는 10센티미터 LB 한천 판에 세균 배양의 플레이트 200 마이크로리터. 하룻밤 사이에 37°C에서 박테리아 인큐베이터에서 LB 한천 플레이트의 박테리아를 배양합니다. 성공적인 식민지 형성 후, 하나의 단일 식민지를 선택하고 선택 된 항생제와 NZCYM의 다섯 밀리리터에 분산.
하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 박테리아 인큐베이터의 배양. 성공적인 세균 성장 후, 단백질 수량의 수요에 따라 250 밀리리터, 500 밀리리터 또는 1 리터 의 매체 배치에서 박테리아를 증폭시하십시오. 그런 다음 박테리아를 문화하여 박테리아 인큐베이터에서 2~3시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
인큐베이션을 따라 포토메트릭 분석을 위해 샘플을 그립니다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.4에 도달하면 200 마이크로몰라를 이소프로필 베타-D-티오갈라크토피라노시드의 최대 1밀리머까지 적용한다. 37섭씨 단백질 발현에서 박테리아 인큐베이터에서 3~5시간 이상 후 단백질 발현이 소진된다.
원심분리를 통해 세균펠릿을 5, 000회 G에서 5분간 수확하십시오. 그런 다음 상체를 버리고 펠릿을 영하 20도에서 동결하여 간단한 보관을 하십시오. 원래 세균 현탁액의 각 250 밀리리터에 대해, 박테리아 펠릿에 선택한 완충제의 5 밀리리터를 적용합니다.
적용된 버퍼 5밀리리터당 베타-메르카토에탄올 10마이크로리터를 추가합니다. 10 밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 긁힘과 파이펫팅을 사용하여 펠릿을 서스펜션으로 기계적으로 강제합니다. 모든 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
그런 다음 서스펜션을 초음파 처리합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 고속으로 30분 동안 원심분리기. 얼음 에 필터 단위로 연속적으로 상체를 필터링합니다.
안정적인 리테이너에 부착하고 니켈 NTA 실행 버퍼로 세척하여 빈 플라스틱 또는 유리 기둥을 준비합니다. 단백질 현탁액의 각 10 밀리리터에 대해 열에 니켈 NTA 아가로즈 슬러리의 500 마이크로 리터를 적용합니다. 니켈 NTA 실행 버퍼로 컬럼을 완전히 채우면 아가로즈 수지를 방해하지 않고 버퍼가 중력에 의해 실행되도록 합니다.
다음으로, 단백질 현탁액을 컬럼에 적용하고 시료가 중력에 의해 통과되도록 한다. 샘플이 통과한 후 컬럼을 니켈 NTA 실행 버퍼로 채웁니다. 컬럼 아래에 UV 투명 큐벳을 놓고 니켈 NTA 용출 버퍼 1밀리리터를 수집합니다.
빈 샘플 대 280 나노미터에서 샘플의 광학 밀도를 확인하십시오. 최적으로, 샘플은 2.5보다 큰 광학 밀도를 표시합니다. FAHD 단백질과 니켈 NTA 용출 완충제는 동결 및 해동 시 침전되며, 투석 버퍼 100밀리리터당 DTT 의 마이크로리터 1개를 사용하여 얼음에서 하룻밤 동안 다른 완충제에 대해 단백질을 투석합니다.
FPLC 시스템을 설정하고 5개의 열 볼륨으로 열을 세척하고 5개의 열 량의 물을 제공합니다. 컬럼을 계평화한 후 투석된 샘플을 열에 적용하고 흐름을 수집합니다. 그라데이션 용출을 설정합니다.
그라데이션이 완료되면 한 열 볼륨 범위에서 더 이상 피크가 감지되지 않을 때까지 높은 염분 버퍼로 실행합니다. 마이크로 플레이트 리더기를 시작하고 섭씨 25도에서 30분 동안 평형화합니다. 효소 분석 버퍼에서 테스트할 기판의 20 밀리머 용액1밀리리터를 준비합니다.
텍스트 프로토콜의 파이펫팅 계획에 따르면, 효소 분석 버퍼 90마이크로리터를 5마이크로리터의 효소 용액으로 우물에 배관하여 효소 블랭크 및 샘플 웰을 준비한다. 그런 다음 95 마이크로리터의 효소 분석 버퍼를 우물에 배관하여 기판 블랭크 및 샘플 웰을 준비합니다. 측정 직전에 5개의 마이크로리터의 효소 분석 버퍼를 6개의 빈 우물에 적용합니다.
20 밀리머 기판 용액의 5개의 마이크로리터를 샘플 웰에 적용합니다. 50 마이크로리터 설정에서 멀티 채널 파이프를 사용하여 우물을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음, 마이크로 플레이트 리더에 플레이트를 삽입하고 255 나노미터에서 각 우물을 측정합니다.
마지막으로 스프레드시트에서 분석을 수행합니다. 최적이고 최적이 아닌 변환 후 LB 천 판의 두 가지 예가 여기에 묘사됩니다. 너무 많은 세균성 식민지는 2개의 많은 박테리아가 도금되었거나 항생제가 만료될 수 있다는 것을 표시합니다.
너무 적은 세균성 식민지는 충분하지 않은 플라스미드가 변환을 위해 사용되었거나 너무 많은 항생제가 박테리아를 선택하는 데 사용되었다는 것을 나타낼 수 있습니다. 밀리그램 수량으로 발현 단백질을 함유한 세균성 펠릿을 수확하고 발현은 SDS 페이지를 통해 검증된다. 일부 문제는 포함 된 신체 또는 발현 되지 않는 단백질을 형성 하는 단백질을 포함 하 여 이 그렇지 않으면 간단한 과정 동안 발생할 수 있습니다.
그의 태그가 단백질을 태그하는 데 사용되는 경우, 니켈 NTA 아가로즈와의 친화 성 염색체는 오염의 대부분을 제거하는 쉽고 저렴한 캡처 방법입니다. 태그가 사용되지 않으면, 암모늄 황산염 침전및 연속 소수성 교환 크로마토그래피의 조합은 또한 단백질을 다른 단백질의 대다수로부터 분리할 수 있다. 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 남은 오염으로부터 더 분리되고 크기 배제 크로마토그래피를 통해 충분히 순수한 단백질을 얻습니다.
특히 설명된 방법 중 어느 것도 어렵지 않습니다. 그러나 모든 방법은 교육이 필요합니다. 첫 번째 시도는 실패할 수 있지만 몇 가지 추가 적응 후에 실험이 성공할 수 있습니다.
여기에 제시된 모든 방법은 단백질 정제의 일반적인 방법입니다. FAHD 단백질에 특화된 비록, 프로토콜은 정화하고 싶은 어떤 단백질든지에 적응될 수 있습니다. 재조합 인간 FAHD-1은 설명된 방법과 고해상도 엑스레이 구조에 의해 얻어졌으며, decarboxylase 및 하이드로라제와 같은 기능으로 FAHD-1에 대한 우리의 이해에 크게 기여하였다.
이 작업에 사용되는 박테리아는 안전 균주이며 위험하지 않습니다. 일반 안전 가이드는 모든 화학 물질에 적용되며 FPLC 컬럼은 주의하여 처리해야 합니다.
