Nosso protocolo descreve métodos de expressão eficiente e purificação do domínio FAH contendo proteínas, mas também proteínas em geral. A proteína FHD-1 desempenha um papel regulatório no ciclo TCA e no metabolismo energético das mitocôndrias. Conseguimos associar a desregulamentação do FHD-1 à senescência celular e informações sobre atividade enzimática e estrutura proteica são geralmente necessárias para entender mecanismos moleculares por trás dos fenótipos observados.
A principal vantagem de expressar proteínas através de sistemas vetoriais indutíveis IPTG é que todos os métodos são relativamente baratos e fáceis de estabelecer em qualquer laboratório. Usando proteínas do tipo poli-histidina em combinação com resinas de níquel NTA, a imensa seletividade da cromatografia de afinidade pode ser empregada a baixo custo. Para a maioria dos propósitos, a proteína obtida nessa qualidade já pode ser suficiente.
FPLC por outras mãos, é um método bem estabelecido e geral com várias vantagens em comparação com outros métodos. Primeiro, insira de 5 a 10 nanogramas de plasmídeos em 100 microliters de bactérias competentes BL21-DE3 pLysS E.coli no gelo. Toque ligeiramente no tubo para misturar o conteúdo.
Mantenha as bactérias no gelo por 30 minutos, batendo suavemente no tubo a cada poucos minutos. Aqueça um agitador termo a 42 graus celsius. Coloque o tubo contendo as bactérias no aparelho e aqueça por 90 segundos.
Em seguida, coloque o tubo no gelo imediatamente. Depois de cinco a 10 minutos no gelo, adicione 600 microliters de meio NZCYM e coloque o tubo em uma incubadora de bactérias. Agite o tubo em velocidade média orientada ao longo da direção de agitação a 37 graus celsius durante uma hora.
Após a incubação, placa 200 microliters da cultura bacteriana em uma placa de ágar lb de 10 centímetros contendo os antibióticos de seleção de escolha. Cultue as bactérias na placa de ágar LB na incubadora de bactérias a 37 graus celsius durante a noite. Após a formação bem sucedida da colônia, escolha uma única colônia e disperse-a em cinco mililitros de NZCYM com os antibióticos selecionados.
Cultura na incubadora de bactérias a 37 graus celsius durante a noite. Após o sucesso do crescimento bacteriano, amplie as bactérias em 250 mililitros, 500 mililitros ou um litro de médio, dependendo da demanda de quantidade de proteína. Em seguida, cultura as bactérias, na incubadora de bactérias a 37 graus celsius por duas a três horas.
Após a incubação, desenhe uma amostra para análise fotométrica. Se a densidade óptica a 600 nanômetros atingiu 0,4, aplique 200 micromolar até um milímetro de isopropílico-beta-D-tiogalactopyranosid. Depois de mais três a cinco horas na incubadora de bactérias a 37 graus celsius a expressão proteica está esgotada.
Colher a pelota bacteriana através de centrífugas a 5.000 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, descarte o supernasce e congele a pelota a menos 20 graus celsius para um breve armazenamento. Para cada 250 mililitros de suspensão bacteriana original, aplique cinco mililitros do tampão selecionado à pelota bacteriana.
Adicione 10 microliters de beta-mercaptoetanol por cinco mililitros de buffer aplicado. Use uma tubulação Pasteur de 10 mililitros para forçar mecanicamente a pelota em suspensão, coçando e pipetando. Transfira toda a suspensão para um tubo de 50 mililitros.
Em seguida, sonicar a suspensão. Em seguida, centrífuga por 30 minutos em alta velocidade a quatro graus celsius. Filtre o sobrenatante consecutivamente com unidades de filtro no gelo.
Prepare uma coluna de plástico ou vidro vazia, anexando-a a um retentor estável e lavando com tampão de corrida NTA de níquel. Para cada 10 mililitros de suspensão proteica aplicam 500 microliters de níquel NTA agarose slurry à coluna. Encha a coluna completamente com o buffer de execução NTA de níquel garantindo não interromper a resina agarose e permitir que o buffer passe por gravidade.
Em seguida, aplique a suspensão proteica na coluna e permita que a amostra passe por gravidade. Depois que a amostra passar, encha a coluna com o buffer de execução NTA de níquel. Coloque um cuvette transparente UV abaixo da coluna e colete um mililitro de tampão de eluição de níquel NTA.
Verifique a densidade óptica da amostra em 280 nanômetros versus uma amostra em branco. O ideal é que a amostra exiba uma densidade óptica superior a 2,5. Uma vez que as proteínas FAHD e o tampão de elução de níquel NTA precipitarão após o congelamento e o descongelamento, digelam a proteína contra um buffer diferente durante a noite no gelo usando um microliter de DTT por 100 mililitros de tampão de diálise.
Configure um sistema FPLC e lave a coluna com cinco volumes de coluna de 20% de etanol seguido de cinco volumes de coluna de água. Após equilibrar a coluna, aplique a amostra dialisada na coluna e colete o fluxo através. Configure uma elução de gradiente.
Após o gradiente ter terminado, execute com tampão de sal alto até que não sejam detectados mais picos ao longo da faixa de um volume de coluna. Inicie um leitor de microplacão e equilibre por 30 minutos a 25 graus celsius. Prepare um mililitro de uma solução de 20 mililitros de um substrato a ser testado no tampão de ensaio de enzimas.
De acordo com o esquema de pipetação no protocolo de texto, prepare a enzima em branco e prove poços, pipetando 90 microliters de tampão de ensaio enzimático nos poços com cinco microlitadores de solução enzimático. Em seguida, prepare o substrato em branco e amostra de poços, pipetando 95 microliters de tampão de ensaio de enzimas nos poços. Logo antes de medir, aplique cinco microliters de tampão de ensaio de enzimas nos seis poços em branco.
Aplique cinco microlitadores da solução de substrato de 20 mililitros nos poços de amostra. Use uma tubulação multicanal a 50 configurações de microliter para misturar suavemente os poços. Em seguida, insira a placa no leitor de microplacão e meça cada poço a 255 nanômetros.
Por fim, realize a análise em uma planilha. Dois exemplos de placas de ágar LB após a transformação ideal e não ideal são retratados aqui. Muitas colônias bacterianas indicam que duas bactérias foram banhadas ou que os antibióticos podem expirar.
Poucas colônias bacterianas podem indicar que ou não foi usado plasmídeo suficiente para a transformação ou que muitos antibióticos foram usados para selecionar as bactérias. A pelota bacteriana contendo a proteína expressa em quantidades de miligramas é colhida e a expressão é verificada através da página SDS. Alguns problemas podem ocorrer durante esse processo simples, incluindo as proteínas que formam corpos de inclusão ou a proteína que não está sendo expressa.
Se uma sua tag é usada para marcar a proteína, a cromatografia de afinidade com níquel NTA agarose é um método de captura fácil e barato eliminando a maioria das contaminações. Se nenhuma etiqueta for usada, uma combinação de precipitação de sulfato de amônio e uma cromatografia de troca hidrofóbica consecutiva também podem separar a proteína da maioria das outras proteínas. A proteína é ainda separada das contaminações remanescentes pela cromatografia de troca de íons, seguida pela cromatografia de exclusão de tamanho para obter uma proteína suficientemente pura.
Nenhum dos métodos descritos é difícil em particular. Mas todos os métodos exigem treinamento. As primeiras tentativas podem falhar, mas os experimentos terão sucesso após algumas adaptações adicionais.
Todos os métodos aqui apresentados são métodos gerais de purificação de proteínas. Embora especializado em proteínas FAHD, o protocolo pode ser adaptado a qualquer proteína que se queira purificar. O FAHD-1 humano recombinante foi obtido pelos métodos descritos e estruturas de raios-X de alta resolução contribuíram maciçamente para a nossa compreensão do FAHD-1 por funcionalidade atuando como ambos, decarboxilase e hidrolase.
As bactérias utilizadas neste trabalho são cepas de segurança e não são perigosas. As guias gerais de segurança aplicam-se a todos os produtos químicos e as colunas FPLC devem ser tratadas com cuidado.
