هذا البروتوكول لفي التعريب المناعي الجسمية، أو IVIL، ويقيم في في الجسم الحية توزيع الكائنات المضادة التشخيصية والعلاجية أو العوامل القائمة على الأجسام المضادة لأبحاث السرطان, الكشف, والعلاج. على النقيض من التلطيخ المناعي التقليدي حيث يتم الكشف عن التعبير الخلوي للمستضدات السابقين ، توضح طريقة IVIL كيفية توزيع الأجسام المضادة والعوامل المستندة إلى الأجسام المضادة في الحيوان الحي. سيساعد هذا الفيديو على فهم سير العمل العام لطريقة IVIL.
وهو يظهر تفاصيل هامة لنجاح استنساخ البروتوكول للتطبيقات الأخرى والأجسام المضادة. مراقبة الفئران من نموذج السرطان المطلوب لنمو الورم المناسب عن طريق الجس أو قياس الفرجر قبل المضي قدما. تنقية الأرانب المضادة للماوس B7-H3 والأرنب IgG الأضاءة على أجسام مراقبة إزالة التشبع على عمود لإزالة المواد الحافظة ومخازن التخزين بعد تعليمات الشركة المصنعة.
جرعات Aliquot من 33 ميكروغرام من كل جسم مضاد متقارن في أنابيب ميكروسيرتيروفوج الفردية. بعد التخدير كما هو موضح في بروتوكول النص، والاستعداد للقح الوريد الذيل من حلول الأجسام المضادة. تطهير ذيل الحيوان عن طريق مسح ثلاث مرات مع مسح الكحول.
تمدد عروق الذيل عن طريق الاحترار مع وسادة الحرارة لمدة 30 ثانية تقريبا. تجنب تسخين الحيوان بأكمله. باستخدام قسطرة الوريد الذيل عيار 27، أدخل إبرة الفراشة في أحد عروق الذيل الجانبيين.
تصور تدفق الدم إلى القسطرة لضمان أن يتم وضع الإبرة بشكل صحيح بحيث الحلول ستدخل تماما الحيوان مقابل القبض في الذيل. استخدام قطعة من الشريط الجراحي لإصلاح بعناية الذيل مع إبرة إدراجها إلى المرحلة. قم بشطف القسطرة بـ 25 ميكرولترات من الملح المعقم المخزنة بالفوسفات.
ثم، حقن محلول الأجسام المضادة في القسطرة باستخدام حقن الأنسولين. تدفق القسطرة مرة أخرى مع 25 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. إزالة الإبرة من الذيل، وتطبيق الضغط لوقف أي نزيف.
أداء القتل الرحيم الإنسانية من الماوس كما هو موضح في بروتوكول النص، ووضع الماوس في موقف supine. استخدام مقص الجراحي والملقط لمعالجة أنسجة الورم. استخدام ملقط لفهم فقط الطبقة الخارجية من الجلد بين مجموعة من الغدد الثديية الأقرب إلى الذيل، وجعل شق صغير مع زوج من مقص الجراحية.
إدخال مقص مغلق في القطع، وفتح ببطء غيض لفصل بعناية الجلد من غشاء جدار البطن الكامنة، والحفاظ على سليمة. إجراء شق عمودي حتى البطن، والاستمرار في فصل الجلد من الغشاء الداخلي. بين الغدد الثديية الثالثة والرابعة، قم بقطع أفقي عبر البطن للسماح بالتراجع عن الجلد وتصور الغدد الثديية.
استيعاب كل ورم أو غدة طبيعية مع ملقط، تقليم بعناية بعيدا الجلد المرفقة باستخدام مقص الجراحية. وضع الأنسجة المقتطعة في قوالب الأنسجة قاعدة المتاح التي يتم تسمية مسبقة ومليئة المثلى خفض درجة الحرارة تضمين المتوسطة. تجميد بسرعة القوالب عن طريق وضع على الجليد الجاف.
من أجل دراسة التسليم خارج الهدف، والمكوس الأنسجة الأخرى أو الأجهزة ذات الأهمية. باستخدام التبريد، مقطع كتل الأنسجة المجمدة في سمك 10 ميكرون، ووضع المقاطع المجاورة على الشرائح الزجاجية التصاق prelabelesed. شطف الشرائح الأنسجة المجمدة مع درجة حرارة الغرفة PBS لمدة خمس دقائق لإزالة المتوسطة المضمنة.
ترسيم أقسام الأنسجة مع قلم حاجز مبيد للماء لتقليل حجم الحلول اللازمة أثناء التلطيخ. إصلاح أقسام الأنسجة مع 4٪ محلول paraformaldehyde لمدة خمس دقائق. بعد شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق، permeabilize أقسام الأنسجة مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
شطف الشرائح مرة أخرى في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. كتلة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 3٪ الوزن لكل حجم الألبومين المصل البقري و 5٪ حجم لكل مصل الماعز حجم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق، احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية لحفظ السجلات مثل علامة مشتركة النووية، وعائي، أو السيتوبلازميك.
هنا، يتم استخدام الجرذان المضادة للماوس CD31 في تخفيف واحد إلى 100 في حل الحجب. تترك الشرائح ذات الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية، محمية من الجفاف على صينية الشرائح. بعد الحضانة، شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ثلاث مرات.
تغيير برنامج تلفزيوني في كل مرة. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية لتسمية الأجسام المضادة الأولية. لهذا التطبيق، تصور المضادة ل-B7-H3 الأجسام المضادة باستخدام اليكسا فلور 546 الماعز مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة، وتصور CD31 مع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للجرذ الأجسام المضادة الثانوية في منع الحل.
حماية الشرائح من الضوء والجفاف على علبة الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني كما كان من قبل، وتطبيق قطرة واحدة من المتوسطة تصاعد في وسط شريحة الأنسجة. ضع غطاء بعناية ، وتجنب فخ فقاعات الهواء.
ختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر واضحة، والسماح لتجف. المضي قدما في التصوير المجهري confocal وتحليل الصور الكمية كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر ميكروجرافات مصغرة تمثيلية مقارنة بين الأجسام المضادة B7-H3 المحددة والمكونة من ICG وغير محددة للتحكم في الأيزوتيب غير المحدد في تعريب الجسم المضاد ICG في الغدد الثديية المورينية التي تحتوي على أنسجة طبيعية أو سرطانية.
الغدد الثديية المورين العادية من حقن عن طريق الوريد مع ISO-ICG أو B7-H3-ICG ومضادة مع CD31 تظهر أي تلطيخ من conjugates الأجسام المضادة. وتبين أن الأنسجة الطبيعية ليس لها أي تعبير عن B7-H3 من قبل معيار السابقين فيفو مناعية تلطيخ. في أورام الثدييات الغازية، B7-H3-ICG يرتبط بقوة إلى الأوعية الدموية، نقطة الاتصال الأولى في الجسم الحي، ومن ثم تكون قادرة على البذخ من الأوعية الدموية لطخة غير متجانسة ظهارة الورم.
يبين ISO-ICG تراكم غير محدد داخل أنسجة الورم. يُظهر التلطّخ المناعي السابق لـ"الزفير" (ڤينو) (رافون) (ڤينو) (2006) تعبيرًا موحّدًا عن علامة B7-H3 على الخلايا الظهارية والبطلانية. تظهر ميكروجرافات مصغرة تمثيلية طريقة تعريب الفلور المناعية في الجسم الحي للكشف عن تعبير netrin-1 أو تعبير التحكم في الإيزو نوع في سرطان السومين والغدد الثديية العادية.
في التوطين المناعي vivo يؤكد إشارة الظهارية لnetrin-1 في أورام MMTV-PyMT ولكن ليس في الغدد الثديية العادية. وعلاوة على ذلك، هناك إشارة قوية نيترين-1 على الخلايا البطانية في أورام الثدي، كما هو مبين في إشارة صفراء كولوك. الإشارة أضعف بكثير في الغدد الثديية العادية.
سوف تحتاج طريقة IVIL إلى أن تكون الأمثل من حيث جرعة الأجسام المضادة, توقيت جمع الأنسجة, وتخفيف الأجسام المضادة الثانوية للتنفيذ الناجح. يسمح IVIL باستهداف الظهارات التكتورية التي لا يمكن اكتشافها باستخدام تلطيخ الفلورس المناعي القياسي ، والذي يتطلب معالجة الأنسجة. أيضا، يمكن جمع الأعضاء الصحية للفئران الحاملة للأورام لتقييم التسليم خارج الهدف من الأجسام المضادة العلاجية.
مع زيادة استخدام العلاجات القائمة على الأجسام المضادة وعوامل التباين في أبحاث السرطان وإدارتها ، فإن طريقة IVIL قابلة للتطبيق بشكل كبير على البحث والتطوير الصيدلاني. قد يجد الباحثون في علاجات السرطان والتصوير الجزيئي والالتهاب وغيرها من المجالات أن طريقة IVIL توفر معلومات مفيدة.
