Dieses Protokoll für die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisierung (IVIL) bewertet die In-vivo-Bioverteilung diagnostischer und therapeutischer Antikörper oder Antikörper-basierter Wirkstoffe für die Krebsforschung, -detektion und -behandlung. Im Gegensatz zur herkömmlichen immunfluoreszenten Färbung, bei der die zelluläre Expression von Antigenen ex vivo offenbart wird, erläutert die IVIL-Methode, wie sich Antikörper und Antikörper-basierte Wirkstoffe im lebenden Tier verteilen. Dieses Video wird das Verständnis des gesamten Workflows der IVIL-Methode unterstützen.
Es zeigt wichtige Details für eine erfolgreiche Reproduktion des Protokolls für andere Anwendungen und Antikörper. Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren. Reinigen Sie Kaninchen Anti-Maus B7-H3 und Kaninchen IgG Isotyp-Kontrollantikörper auf einer Entsalzungssäule, um Konservierungsstoffe und Speicherpuffer nach den Anweisungen des Herstellers zu entfernen.
Aliquot Dosierungen von 33 Mikrogramm jedes Antikörperkonjugats in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Anästhesisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Endschwanzvenenimpfung der Antikörperlösungen vor. Desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie dreimal mit einem Alkoholwisch wischen.
Die Schwanzvenen durch Erwärmung mit einem Wärmepolster für ca. 30 Sekunden delateieren. Vermeiden Sie das Erhitzen des gesamten Tieres. Mit einem 27-Spur-Schwanzvenenkatheter legen Sie die Schmetterlingsnadel in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen ein.
Visualisieren Sie den Blutrückfluss in den Katheter, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig platziert wird, so dass die Lösungen vollständig in das Tier gelangen, anstatt im Schwanz gefangen zu werden. Verwenden Sie ein Stück operationsekband, um den Schwanz mit der eingesetzten Nadel vorsichtig auf die Bühne zu fixieren. Spülen Sie den Katheter mit 25 Mikroliter steriler Phosphat-gepufferter Saline.
Anschließend injizieren Sie die Antikörperlösung mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter noch einmal mit 25 Mikroliter sterilem PBS. Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz, und wenden Sie Druck auf, um jegliche Blutung zu stoppen.
Führen Sie eine humane Euthanasie der Maus durch, wie im Textprotokoll beschrieben, und legen Sie die Maus in die Supine-Position. Verwenden Sie chirurgische Schere und Zangen, um Tumorgewebe zu verbrauchen. Verwenden Sie Zangen, um nur die äußere Schicht der Haut zwischen dem Satz der Brustdrüsen am nächsten zum Schwanz zu erfassen, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer chirurgischen Schere.
Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen und sie intakt zu halten. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in den Bauch, weiterhin die Haut von der inneren Membran zu trennen. Zwischen der dritten und vierten Brustdrüse, machen Sie einen horizontalen Schnitt über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen.
Greifen Sie jeden Tumor oder normale Drüse mit Zangen, vorsichtig trimmen Sie die befestigte Haut mit chirurgischer Schere. Legen Sie ausgeschnittene Gewebe in Einweg-Basisformen des Gewebes, die voretikettiert und mit einem optimalen Schnitttemperatur-Einbettmedium gefüllt sind. Die Formen schnell einfrieren, indem man sie auf Trockeneis platziert.
Um die Off-Target-Lieferung zu untersuchen, verbrauchen Sie andere Gewebe oder Organe von Interesse. Mit einem Kryostat, Abschnitt gefrorene Gewebeblöcke mit 10-Mikron Dicke, und legen Sie angrenzende Abschnitte auf vorbeschriftete Adhäsion Glasrutschen. Spülen Sie gefroreneGewebe diagletten mit Raumtemperatur PBS für fünf Minuten, um das Einbettmedium zu entfernen.
Dearcate Gewebeabschnitte mit einem hydrophoben Barriere-Stift, um das Volumen der Lösungen während der Färbung benötigt zu reduzieren. Fixieren Sie die Gewebeabschnitte mit 4%Paraformaldehyd-Lösung für fünf Minuten. Nach dem Spülen der Dias in PBS für fünf Minuten, permeabilisieren Gewebeabschnitte mit 0,5%Triton X-100 in PBS für 15 Minuten.
Spülen Sie die Dias erneut in PBS für fünf Minuten. Blockieren Sie das Gewebe mit PBS mit einem Gewicht von 3 % pro Volumen Rinderserumalbumin und 5 % Volumen pro Volumen Ziegenserum für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Spülen der Dias in PBS für fünf Minuten, inkubieren Sie die Abschnitte mit Aufzeichnungen primäre Antikörper wie eine gemeinsame kern-, vaskuläre, oder zytoplasmatische Marker.
Hier bei einer Ein-zu-100-Verdünnung in der Blockierlösung wird Ratten-Anti-Maus-CD31 eingesetzt. Die Dias mit Primärantikörpern werden über Nacht bei vier Grad Celsius gelassen, geschützt vor Austrocknung auf einem Diatablett. Nach der Inkubation spülen Sie die Dias in PBS dreimal für fünf Minuten.
Ändern Sie die PBS jedes Mal. Inkubieren Sie die Dias mit sekundären Antikörpern, um die primären Antikörper zu kennzeichnen. Für diese Anwendung, visualisieren Anti-B7-H3 Antikörper mit Alexa Fluor 546 konjugierten Ziege Anti-Kaninchen-Antikörper, und visualisieren CD31 mit Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Ratten Sekundärantikörper in Blockierlösung.
Schützen Sie die Dias eine Stunde lang bei Raumtemperatur vor Licht und Austrocknung auf einem Diatablett. Nach dem Spülen der Dias in PBS wie zuvor, einen Tropfen des Montagemediums in die Mitte der Gewebescheibe auftragen. Legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf, um das Einwickeln von Luftblasen zu vermeiden.
Versiegeln Sie die Ränder des Deckels mit klarem Nagellack und lassen Sie sie trocknen. Fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung und quantitativen Bildanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative konfokale Mikrographien zeigen den Vergleich spezifischer B7-H3-Antikörper-ICG-Konjugat- und unspezifischer Isotyp-Kontroll-Antikörper-ICG-Konjugatlokalisierung in murinen Brustdrüsen, die normales oder karzinomhaltiges Gewebe enthalten.
Normale murinische Brustdrüsen von einem Tier, das intravenös mit Iso-ICG oder B7-H3-ICG injiziert und mit CD31 kontragefärbt ist, zeigen keine Färbung der Antikörperkonjugate. Es wurde gezeigt, dass normale Gewebe keine Expression von B7-H3 durch Standard-Ex-vivo-Immunfluoreszenzfärbung haben. Bei invasiven Brusttumoren bindet B7-H3-ICG stark an die Vaskulatur, den ersten Kontaktpunkt in vivo, und ist dann in der Lage, aus der Vaskulatur zu extravasieren, um das Tumorepithel heterogen zu färben.
Iso-ICG zeigt unspezifische Akkumulation innerhalb des Tumorgewebes. Die Standard-Ex-vivo-Immunfluoreszenzfärbung zeigt eine gleichmäßige Expression des B7-H3-Markers auf epitheliale und endotheliale Zellen. Repräsentative konfokale Mikrographien zeigen die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisierungsmethode zum Nachweis der Netrin-1-Expression oder der Isotypkontrollexpression bei murinen Karzinom und normalen Brustdrüsen.
In vivo Immunfluoreszenzlokalisierung bestätigt epitheliale Signal für Netrin-1 in MMTV-PyMT Tumoren, aber nicht in normalen Brustdrüsen. Darüber hinaus gibt es ein starkes Netrin-1-Signal auf Endothelzellen in Brusttumoren, wie durch das kolokalisierte gelbe Signal angezeigt. Das Signal ist in normalen Brustdrüsen deutlich schwächer.
Die IVIL-Methode muss in Bezug auf DieAntikörperdosierung, Gewebesammlung Timing und sekundäre Antikörperverdünnung für eine erfolgreiche Umsetzung optimiert werden. IVIL ermöglicht die Ausrichtung auf konforme Epitope, die nicht mit Standard-Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen werden können, die eine Gewebeverarbeitung erfordert. Auch können gesunde Organe von tumortragenden Mäusen gesammelt werden, um die abwegige Abgabe von therapeutischen Antikörpern zu bewerten.
Durch den verstärkten Einsatz von Antikörper-basierten Therapeutika und Kontrastmitteln in der Krebsforschung und -therapie ist die IVIL-Methode sehr gut auf die pharmazeutische Forschung und Entwicklung anwendbar. Forscher in Krebstherapien, molekulare Bildgebung, Entzündungen und anderen Bereichen können feststellen, dass die IVIL-Methode nützliche Informationen liefert.
