생체 내 면역형광국화 또는 IVIL을 위한 이 프로토콜은 암 연구, 검출 및 치료를 위한 진단 및 치료 항체 또는 항체 기반 제제의 생체 내 생체 분포를 평가한다. 항원의 세포 발현이 밝혀진 종래의 면역형성 염색과는 대조적으로, IVIL 방법은 살아있는 동물에서 항체 및 항체 기반 제제가 어떻게 분배되는지 해명한다. 이 비디오는 IVIL 메서드의 전반적인 워크플로우를 이해하는 데 도움이 됩니다.
그것은 다른 응용 프로그램 및 항체에 대한 프로토콜의 성공적인 재생산을위한 중요한 세부 사항을 보여줍니다. 진행하기 전에 심Pation 또는 캘리퍼 측정을 통해 적절한 종양 성장을 원하는 암 모델에서 마우스를 관찰한다. 토끼 안티 마우스 B7-H3 및 토끼 IgG 등형 제어 항체를 탈염 컬럼에 정화하여 제조업체 지침에 따라 방부제 및 저장 버퍼를 제거합니다.
개별 미세 원심 분리기 튜브에서 각 항체 컨쥬게이트의 33 마이크로그램의 Aliquot 투여량. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 마취에 따라 항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비한다. 알코올 닦아세면 동물의 꼬리를 소독합니다.
약 30초 동안 열패드로 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 팽창시다. 전체 동물을 가열하지 마십시오. 27 게이지 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 나비 바늘을 삽입합니다.
카테터에 혈액 역류를 시각화하여 바늘이 제대로 배치되어 솔루션이 꼬리에 포획되는 것과 동물을 완전히 입력할 수 있도록 합니다. 수술 용 테이프를 사용하여 삽입 된 바늘로 꼬리를 조심스럽게 수정합니다. 카테터를 멸균 인산염 완충식식염 25마이크로리터로 씻어내면 됩니다.
그런 다음, 인슐린 주사기를 사용하여 카테터에 항체 용액을 주입한다. 멸균 PBS의 25 마이크로 리터와 카테터를 다시 한번 플러시. 꼬리에서 바늘을 제거하고, 출혈을 중지 압력을 적용합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스의 인도적인 안락사를 수행하고 마우스를 supine 위치에 놓습니다. 종양 조직을 절제하기 위하여 외과 가위와 집게를 사용하십시오. 집게를 사용하여 꼬리에 가장 가까운 유방 땀샘 세트 사이의 피부 외부 층만 파악하고 수술 가위로 작은 절개를합니다.
닫힌 가위를 절단에 넣고 팁을 천천히 열어 피부를 기본 복벽 막과 조심스럽게 분리하여 그대로 유지합니다. 복부를 수직으로 절개하여 피부를 내부 막과 분리하십시오. 세 번째와 네 번째 유방 땀샘 사이에, 피부의 후퇴와 유방 땀샘의 시각화를 허용하기 위해 복부를 가로 질러 수평 컷을합니다.
각 종양 이나 일반 동맥을 집게로 잡고 외과 가위를 사용하여 부착 된 피부를 조심스럽게 다듬습니다. 절제된 조직을 미리 표지되고 최적의 절삭 온도가 포함되는 조직 일회용 염기 몰드에 놓습니다. 드라이 아이스에 배치하여 금형을 신속하게 동결합니다.
오프 타겟 전달을 연구하기 위해 다른 조직이나 관심 기관을 소비합니다. 저온기를 사용하여 10미크론 두께로 단면 고정 된 조직 블록을 만들고 인접한 섹션을 미리 표지된 접착 유리 슬라이드에 놓습니다. 냉동 티슈 슬라이드를 실온 PBS로 5분간 헹구어 내장 매체를 제거합니다.
염색 하는 동안 필요한 솔루션의 볼륨을 줄이기 위해 소수성 장벽 펜조직 섹션을 마마로테. 4%의 파라포름알데히드 용액으로 조직 섹션을 5분간 수정합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구고, PBS에서 0.5%의 트리톤 X-100을 15분 동안 과미로 분류합니다.
5분 동안 PBS에서 슬라이드를 다시 헹구십시오. 볼륨 소 세럼 알부민당 3%의 중량과 실온에서 1시간 동안 부피 염소 세럼당 5%의 부피를 함유한 PBS로 조직을 차단합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구고, 일반적인 핵, 혈관 또는 세포질 마커와 같은 기록 보관 1차 항체로 섹션을 배양한다.
여기서, 쥐 안티 마우스 CD31은 차단 용액에서 일대일 100 희석에 사용된다. 1차 항체가 있는 슬라이드는 밤새 섭씨 4도에 남아 있으며 슬라이드 트레이의 탈수로부터 보호됩니다. 인큐베이션에 따라 PBS에서 슬라이드를 세 번 5분간 헹구십시오.
매번 PBS를 변경합니다. 1 차 항체를 표지하기 위해 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 이 적용을 위해 알렉사 플루오(546)를 이용한 항B7-H3 항체를 시각화하고, 차단용에서 알렉사 플루어 488 염소 항쥐 이차 항체로 CD31을 시각화한다.
슬라이드 트레이의 조명과 탈수로부터 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 보호합니다. 이전과 같이 PBS에서 슬라이드를 헹구고, 티슈 슬라이스의 중앙에 장착 매체의 한 방울을 적용합니다. 조심스럽게 기포의 함정을 피하기 위해 커버 슬립을 배치합니다.
뚜껑 가장자리를 명확한 매니큐어로 밀봉하고 건조시키십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 공초점 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석을 진행합니다. 대표적인 공초점 현미경 사진은 정상 또는 암종 조직을 포함하는 뮤린 유방 땀샘에서 특정 B7-H3 항체-ICG 컨쥬게이트 및 비특이적 동위원소 대조군 항체-ICG 컨쥬게이트 국소화를 비교하는 것을 보여준다.
이소-ICG 또는 B7-H3-ICG로 정맥 주사하고 CD31로 대응하는 동물의 정상적인 명골 모샘은 항체 컨쥬게이트의 염색을 보이지 않는다. 정상 조직은 표준 전 생체 면역 형광 염색에 의해 B7-H3의 발현이 없는 것으로 나타났다. 침습성 유방 종양에서 B7-H3-ICG는 생체 내첫 접촉 지점인 혈관에 강하게 결합한 다음 혈관에서 이질적으로 종양 상피를 염색할 수 있습니다.
ISO-ICG는 종양 조직 내의 비특이적 축적을 보여줍니다. 표준 전 생체 내 피세포 에 B7-H3 마커의 균일 한 발현을 나타낸다. 대표적인 공초점 현미경사진은 악성암과 정상 유방땀샘에서 넷린-1 발현 또는 등류형 대조현을 검출하는 생체 내 면역형국화 방법을 보여준다.
생체 내 면역플루오에시언국화는 MMTV-PyMT 종양에서 넷린-1에 대한 상피 신호를 확인하지만 정상적인 유방 땀샘에서는 확인되지 않습니다. 더욱이, 유 방 종양의 내피 세포에 강한 넷린-1 신호가 있다, 공동화 된 황색 신호에 의해 표시. 신호는 일반적인 유방 선지에서 상당히 약합니다.
IVIL 방법은 항체 투여량, 조직 수집 타이밍 및 이차 항체 희석의 관점에서 최적화되어야 성공적인 구현을 위해 최적화되어야 합니다. IVIL은 조직 처리를 필요로 하는 표준 면역 형광 얼룩을 사용하여 검출될 수 없는 형성 전형의 표적을 허용합니다. 또한 종양 을 낳는 마우스의 건강한 장기는 치료 항체의 오프 타겟 전달을 평가하기 위해 수집 될 수 있습니다.
암 연구 및 관리에서 항체 기반 치료제 및 조영제의 사용이 증가함에 따라 IVIL 방법은 제약 연구 및 개발에 매우 적용 가능합니다. 암 치료, 분자 이미징, 염증 및 기타 분야의 연구원은 IVIL 방법이 유용한 정보를 제공한다는 것을 발견 할 수 있습니다.
