インビボ免疫蛍光局在局(IVIL)のためのこのプロトコルは、がん研究、検出、および治療のための診断および治療用抗体または抗体ベースの薬剤の生体分布を評価する。IVIL法は、抗原の細胞発現がex vivoで明らかにされる従来の免疫蛍光染色とは対照的に、抗体および抗体ベースの薬剤が生きている動物でどのように分布するかを解明する。このビデオは、IVILメソッドの全体的なワークフローの理解を助ける。
他のアプリケーションおよび抗体に対するプロトコルの再生を成功させるための重要な詳細を示す。先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからのマウスを観察する。脱塩カラム上のウサギの抗マウスB7-H3およびウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を精製し、メーカーの指示に従って防腐剤と保存バッファーを除去します。
個々のマイクロ遠心分離管における各抗体コンジュゲートの33マイクログラムのアリコート投与量。テキストプロトコルに記載されている麻酔に続いて、抗体溶液の尾静脈接種に備える。アルコール拭きで3回拭いて動物の尾を消毒する。
ヒートパッドで約30秒間温めることで尾静脈を拡張します。動物全体を加熱しないでください。27ゲージの尾静脈カテーテルを使用して、2つの側面尾静脈の1つに蝶の針を挿入します。
カテーテルに血流を視覚化して、針が適切に配置され、溶液が動物に完全に入り込み、尾に捕捉されるようにします。手術用テープを使用して、挿入された針で尾を慎重にステージに固定します。25マイクロリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水でカテーテルを洗い流します。
次いで、インスリン注射器を用いてカテーテルに抗体溶液を注入する。滅菌PBSの25マイクロリットルでカテーテルをもう一度洗い流します。針を尾から取り出し、圧力をかけて出血を止めます。
テキストプロトコルに記載されているようにマウスの人道的安楽死を行い、仰向けの位置にマウスを置く。手術用ハサミと鉗子を使って腫瘍組織を切除する。鉗子を使用して、尾部に最も近い乳腺の組み合わせの間の皮膚の外層だけを把握し、外科用ハサミで小さな切開を行います。
閉じたはさみをカットに導入し、ゆっくりと先端を開いて下の腹壁膜から皮膚を慎重に分離し、そのままに保ちます。腹部を垂直に切開し、皮膚を内膜から分離し続けます。3番目と4番目の乳腺の間で、皮膚の引き込みと乳腺の視覚化を可能にするために腹部を横切って水平に切り取る。
各腫瘍または正常腺を鉗子でつかみ、外科用ハサミを使用して取り付けた皮膚を慎重に切り取る。切除された組織を、あらかじめラベル付けされ、最適な切断温度埋め込み媒体で満たされたティッシュの使い捨てベース型に入れます。ドライアイスに配置することで、金型を素早く凍結します。
オフターゲットの送達を研究するために、他の組織または関心のある器官を物品化する。クライオスタットを使用して、10ミクロンの厚さの凍結組織ブロックを切り離し、隣接するセクションをあらかじめラベル付けされた接着ガラススライドの上に置きます。凍結した組織スライドを室温PBSで5分間リンスし、埋め込み培地を除去する。
組織切片を疎水性バリアペンで区切り、染色時に必要な溶液の量を減らします。4%パラホルムアルデヒド溶液で組織切片を5分間固定します。スライドをPBSで5分間リンスした後、PBSで0.5%トリトンX-100で組織切片を15分間透過させる。
PBS でスライドを再び 5 分間リンスします。1ボリュームのウシ血清アルブミンあたり3%の重量と室温で1時間の体積ヤギ血清あたり5%の体積を含むPBSで組織をブロックします。PBSでスライドを5分間リンスした後、一般的な核、血管、または細胞質マーカーなどの記録保持一次抗体で切片をインキュベートします。
ここで、ラット抗マウスCD31は、ブロッキング溶液中の1対100希釈で使用される。一次抗体を有するスライドは、スライドトレイの脱水から保護された摂氏4度で一晩放置される。インキュベーションに続いて、PBSでスライドを5分間3回すすいだ。
毎回 PBS を変更します。一次抗体を標識する二次抗体でスライドをインキュベートします。このアプリケーションでは、アレクサフルオール546コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を使用して抗B7-H3抗体を可視化し、ブロッキング溶液中のアレクサフルーオール488ヤギ抗ラット二次抗体を用いてCD31を可視化します。
スライドトレイの軽い脱水症状から、室温で1時間保護します。前のようにPBSでスライドをすすぐ後、組織スライスの中央に取り付け媒体の1滴を塗布する。気泡の封じ込めを避け、慎重にカバースリップを置きます。
カバースリップの端を透明なマニキュアで密封し、乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡イメージングと定量画像解析を進めます。代表的な共焦点顕微鏡写真は、正常または癌腫組織を含むマウス乳腺における特異的B7-H3抗体ICGコンジュゲートおよび非特異的アイソタイプ対照抗体ICGコンジュゲートの局在化の比較を示す。
イソ-ICGまたはB7-H3-ICGを静脈内注射した動物からの正常なマウス乳腺およびCD31で染色されたカウンターは、抗体コンジュゲートの染色を示さない。正常組織は、標準的なex生体免疫蛍光染色法によるB7-H3の発現を有さないことを示した。浸潤性乳腺腫瘍では、B7-H3-ICGは、生体内の最初の接触点である血管系に強く結合し、その後、血管系から腫瘍上皮を不均一に染色するために外乳化することができる。
イソICGは、腫瘍組織内の非特異的蓄積を示す。標準的なex vivo免疫蛍光染色は、上皮細胞および内皮細胞上のB7-H3マーカーの均一な発現を示す。代表共焦点顕微鏡写真は、マウス癌および正常乳腺におけるネトリン-1発現またはアイソタイプ制御発現を検出するin vivo免疫蛍光局在化法を示す。
生体内免疫蛍光局在化は、MMTV-PyMT腫瘍ではネトリン-1の上皮シグナルを確認するが、正常な乳腺では確認しない。さらに、共局化した黄色のシグナルによって示されるように、乳房腫瘍の内皮細胞に強いネトリン-1シグナルがある。正常乳腺では信号が著しく弱い。
IVIL法は、抗体投薬量、組織採取タイミング、二次抗体希釈の観点から最適化して実装を成功させる必要があります。IVILは組織処理を必要とする標準的な免疫蛍光染色を使用して検出できない立体構造エピトープを標的化することを可能にする。また、腫瘍を持つマウスの健康な器官を収集して、治療用抗体のオフターゲット送達を評価することができる。
がんの研究・管理における抗体系治療薬や造影剤の使用が増加する中、IVIL法は医薬品の研究開発に非常に応用可能です。がん治療、分子イメージング、炎症、その他の分野の研究者は、IVIL法が有用な情報を提供することを発見するかもしれません。
