إن فوسفات إينوزيتول والفوسفوينوسيتيدات هي مستقلبات لها وظائف تنظيمية عديدة في نوى نياريوتي، بما في ذلك التحكم في التعبير الجيني، والاتجار بالبروتين، وإشارات نقل البيانات، وتطوير الخلايا. أنها تؤدي هذه الوظيفة التنظيمية عن طريق ربط البروتينات، وبالتالي تغيير بروتين التشكل، والنشاط الحفاز، أو التفاعلات البروتين. تحديد البروتينات التي ترتبط فوسفات إينوزيتول أو فوسفينوسيتيدس ضروري لفهم كيفية أداء تلك الأيضات وظيفتها التنظيمية.
يحتوي هذا البروتوكول على سير عمل بسيط حساس وغير مشع ومجاني ويستخدم الكواشف المتاحة تجاريًا. في هذه الطريقة، يتم استخدام التصوير اللوني الانتهاء مع الفوسفات إينوزيتول biotinylated أو فوسفينوسيتيديسيد، لعزل البروتينات التفاعل، ثم يتم تحديدها بواسطة لطخة الغربية، أو قياس الطيف الشامل. لأشكال مجرى الدم، تنمو الخلايا T.brucei إلى منتصف مرحلة السجل في وسائل الإعلام HMI-9، تكملها 10٪ FBS، في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
الحفاظ على كثافة الخلية بين 800، 000 و 1.6 مليون خلية لكل ملليلتر. عندما تكون جاهزة، الطرد المركزي الخلايا في 1600 مرات G، وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant، وإعادة بلطف بيليه في 10 milliletres من برنامج تلفزيوني-G ساخنة مسبقا في 37 درجة مئوية لغسل الخلايا.
الطرد المركزي الخلايا في 1600 مرات G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لإكمال الغسيل. كرر هذا الإجراء غسل مرتين أكثر. ثم إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني-G.
نقل هذا التعليق إلى نقطة واحدة أنبوب 5 ملليلتر، ثم الطرد المركزي في 1600 مرات G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، وssuspend بيليه في نقطة الصفر خمس ملليلتر من العازلة تحلل، تستكمل مع نقطة واحدة خمسة X protease المانع كوكتيل، واحد X فوسفاتاز المانع كوكتيل التي تم تبريدها مسبقا على الجليد لتحلل الخلايا. الطرد المركزي في 1400 مرة G وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد هذا جمع المابير، الذي يحتوي على البروتينات الطفيلية المستخرجة، في نقطة واحدة جديدة أنبوب خمسة ملليلتر للمقايس ملزمة. جانبا 5٪ من lysate الإجمالي لتحليل البقع الغربية. جمع 50 ميكرولترات من الفوسفات إينوزيتول أو فوسفينوسيتيدات مترافق إلى الخرز agarose, وإضافة 500 ملليلتر من العازلة ملزمة.
جهاز طرد مركزي في 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. تجاهل supernatant ، وإعادة الربط في 50 ميكرولترات من العازلة ملزمة لتكبيل الخرز. استخدام الخرز غير مترافق كتحكم، واستخدام الخرز مع تكوينات فوسفات مختلفة بما في ذلك أشكال غير الفوسفورية، للسيطرة على التفاعلات غير محددة.
بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من الخرز IP أو PI إلى الخلية أو البروتينات النقية. الحفاظ على حجم الخرز في حدود 10٪ من lysate الإجمالي. إذا لزم الأمر، استخدم المخزن المؤقت الملزم لضبط حجم رد فعل الربط.
احتضان رد الفعل لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، في حين تدور في 50rpm. بعد هذا، الطرد المركزي في مزيج 1000 مرات G، وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة عظمى، والحفاظ على بيليه، مع التأكد من الحفاظ على 5٪ من supernatant لتحليل البقعة الغربية.
ثم إضافة ملليلتر واحد من العازلة الغسيل والصنبور أو دوامة الأنبوب لإعادة تعليق الراتنج. الطرد المركزي رد الفعل في 1000 مرة G، وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة، والتخلص من الفائق. كرر هذه العملية لما مجموعه خمسة يغسل.
بعد هذا، إضافة 50 ميكروليترس من 2X Laemmli العازلة تكملها 710 ميليمولار 2-mercaptoethanol إلى الخرز. اضغط أو دوامة لخلط، وتمييع البروتينات. بعد ذلك، الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، والطرد المركزي في 10،000 مرات G لمدة دقيقة واحدة.
جمع المابير، وإما تجميد الوميروز في ناقص 80 درجة مئوية، أو المضي قدما في تحليل البقع الغربية. الأسلوب المعروض هنا يستخدم لتحليل ربط PIs بواسطة بروتين الكبت المنشط 1 من T.brucei lysate ، أو عن طريق T.brucei المؤتلفة T.brucei قمع المنشط البروتين 1 البروتين. كما تفتقر RAP1 المجالات ملزمة PI الكنسي, يتم تنفيذ عمليات الفحص الملزمة مع PIs التي هي غير الفوسفورية, أو التي phosphorylated في مواقف مختلفة من حلقة إينوزيتول, ومع الخرز agarose غير متقارنة.
التحليل الغربي يبين أن RAP1 يرتبط بشكل تفضيلي إلى PI (3، 4، 5) خرزات P3، ولكن أيضا أنه يربط إلى حد أقل إلى PI(4، 5) خرز P2. ومع ذلك، فإنه لم يرتبط بأي PIs أخرى أو الخرز agarose. لاختبار ما إذا كان RAP1 يرتبط مباشرة بـ PIs ، يتم التعبير عن بروتين 6XHis المؤتلف من 6XHis المؤتلف وتنقيته إلى تجانس من E.Coli.
يظهر النشاف الغربي أن زيادة تركيز PI (3، 4، 5) P3، ولكن ليس PI(4، 5)P2، يمنع التفاعل من RAP1 المؤتلف مع PI(3، 4، 5) خرز P3. إضافة T.brucei تنقية انزيم PIP5Pase إلى رد فعل استعادة PI (3، 4، 5) P3 ملزمة من قبل RAP1 المؤتلف. ويرجع ذلك إلى PIP5Pase dephosphorylation من PI الحرة (3, 4, 5) P3, وبالتالي يشير إلى أن نمط الفوسفور من هذا المستقلب ضروري لراب1 لدينا ملزمة.
البروتينات التي ترتبط بـ Ins(1، 4، 5) P3 يتم تحديدها بعد ذلك بواسطة اللوني المتقاربة متبوعة بالمسح الطيفي الكتلي. تحليل SDS-PAGE يظهر الإثراء في البروتينات مائل من Ins(1، 4، 5) خرزات P3، مقارنة مع البروتينات مائل من الخرز agarose السيطرة. تحليل الطيف الكتلي للبروتينات المائلة حددت أكثر من 250 البروتينات منها 84 المخصب مع Ins (1، 4، 5) خرز P3، مقارنة مع الخرز التحكم.
إن إثراء البروتينات المرتبطة بـ Ins(1, 4, 5)P3, مقارنة مع الخرز التحكم, يرتبط مع إشارة البروتين التي اكتشفتها SDS-PAGE. ومن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول استخدام الضوابط المناسبة، للتمييز بين التفاعلات غير المحددة. نوصي باستخدام الخرز agarose غير مترافق, والخرز المقترنة مع فوسفات إينوزيتول أو فوسفوينوزيتيديس, باستخدام تكوينات الفوسفات المختلفة, بما في ذلك أشكال غير الفوسفورية.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على الطفيليات البروتوزوانية أحادية الخلية الأخرى ، مثل تريبانوزوما كروزي ، الليشمانيا ، أو البلازموديوم. ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة مع الكائنات الحية الأخرى، بما في ذلك الخميرة أو خلايا الثدييات. ويمكن أن يقترن هذا الأسلوب إلى القياس الطيفي الكتلة الكمية, مثل سيلاك, لتحديد التفاعلات الديناميكية من البروتينات مع فوسفات إينوزيتول أو فوسفوينوستيدات.
في يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع تجزئة تحت الخلية, لتحديد البروتينات العضوية محددة التي ترتبط هذه الأيض. وقد ساعد هذا النهج لتحديد البروتينات التي ترتبط الفوسفات إينوزيتول وفوسفينوسيتيديس في T.brucei, خلايا الثدييات, والخميرة. وقد ساعد في تحديد مجالات البروتين الجديدة التي ترتبط فوسفينوسيتيدس.
وقد مهدت الطريق لفهم الوظيفة التنظيمية لهذه الأيضات، ودورها في التعبير الجيني، وتطوير الخلايا، وإشارات نقل في eukaryotes. بعض الكواشف في هذا البروتوكول سامة، أو قابلة للاشتعال. استخدام معدات الحماية الشخصية، وعند الضرورة، والعمل في غطاء الدخان.
