Le phosphate d’inositol et les phosphoinositides sont des métabolites qui ont plusieurs fonctions réglementaires chez les eucaryotes, y compris le contrôle de l’expression des gènes, le trafic de protéines, la transduction de signaux et le développement cellulaire. Ils remplissent ces fonctions réglementaires en se liant aux protéines, modifiant ainsi la conformation des protéines, l’activité catalytique ou les interactions protéiques. L’identification des protéines qui se lient au phosphate d’inositol ou aux phosphoinositides est essentielle pour comprendre comment ces métabolites remplissent leur fonction de régulation.
Ce protocole a un flux de travail simple qui est sensible, non radioactif, sans lyposome et utilise des reagents qui sont disponibles dans le commerce. Dans cette méthode, une chromatographie finie avec phosphate d’inositol biotinylated ou phosphoinositides, est employée pour isoler les protéines en interaction, elles sont alors identifiées par tache occidentale, ou spectrométrie de masse. Pour les formes de flux sanguins, faire croître les cellules T.brucei jusqu’à la phase médiane de la notation dans les médias HMI-9, complétées par 10 % de FBS, à 37 degrés Celsius, avec 5 % de dioxyde de carbone.
Gardez la densité cellulaire entre 800 000 et 1,6 million de cellules par millilitre. Une fois prêtes, centrifuger les cellules à 1600 fois G, et à température ambiante pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et réutilisez doucement la pastille dans 10 milliletres de PBS-G préchauffés à 37 degrés Celsius pour laver les cellules.
Centrifuger les cellules à 1600 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes pour terminer le lavage. Répétez cette procédure de lavage deux fois de plus. Puis resuspendez la pastille en un millilitre de PBS-G.
Transférer cette suspension sur un tube d’un point de cinq millilitres, puis la centrifugeuse à 1600 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant, et resuspendez la pastille en zéro point cinq millilitres de tampon de lyse, complétée par un point cinq X protéase inhibiteur cocktail, et un cocktail inhibiteur de phosphatase X qui a été pré-refroidi sur la glace pour lyser les cellules. Centrifugeuse le lysate à 1400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après cela recueillir le supernatant, qui contient les protéines parasites extraites, dans un nouveau tube d’un point de cinq millilitres pour les analyses de liaison. Réserver 5 % du lysate total pour l’analyse des taches occidentales. Recueillir 50 microlitres de phosphates d’inositol ou de phosphoinositides conjugués à des perles d’agarose, et les ajouter 500 millilitres de tampon liant.
Centrifugeuse à 1000 fois G pendant une minute. Jetez le supernatant et resuspendez dans 50 microlitres de tampon liant pour équilibrer les perles. Utilisez des perles non conjuguées comme un contrôle, et utilisez des perles avec différentes configurations de phosphate, y compris les formes non phosphorylatées, pour contrôler les interactions non spécifiques.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de perles IP ou PI au lysate cellulaire ou aux protéines purifiées. Gardez le volume de perles dans les 10% du lysate total. Si nécessaire, utilisez un tampon de liaison pour ajuster le volume de la réaction de liaison.
Incuber la réaction pendant une heure ou une nuit à quatre degrés Celsius, tout en tournant à 50rpm. Après cela, centrifuger le mélange à 1000 fois G, et à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirez le supernatant et gardez la pastille, en vous assurant de conserver 5 % du surnatant pour l’analyse des taches occidentales.
Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lavage et appuyez ou faites tourbillonner le tube pour résuspendre la résine. Centrifuger la réaction à 1000 fois G, et à quatre degrés Celsius pendant une minute, et jeter le surnatant. Répétez ce processus pour un total de cinq lavages.
Après cela, ajouter 50 microlitres de tampon 2X Laemmli complété par 710 millimolar 2-mercaptoéthanol aux perles. Appuyez sur ou vortex pour mélanger et diluer les protéines. Ensuite, chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, et centrifugeuse à 10 000 fois G pendant une minute.
Recueillir le surnatant, et soit congeler l’élitate à moins 80 degrés Celsius, ou procéder à l’analyse des taches occidentales. La méthode présentée ici est utilisée pour analyser la liaison des IPP par protéine répresseur-activateur 1 du lysate T.brucei, ou par la protéine recombinante T.brucei répresseur-activateur 1 protéine. Comme RAP1 n’a pas de domaines canoniques de liaison PI, les analyses de liaison sont effectuées avec des IP qui ne sont pas phosphorylatés, ou qui sont phosphorylatés à différentes positions de l’anneau d’inositol, et avec des perles d’agarose non conjuguées.
L’analyse occidentale montre que RAP1 se lie préférentiellement aux perles PI(3, 4, 5)P3, mais qu’elle se lie aussi dans une moindre mesure aux perles PI(4, 5)P2. Cependant, il ne s’est lié à aucune autre IC ou perles d’agarose. Pour vérifier si RAP1 se lie directement aux IPP, une protéine RAP1 recombinante 6XHis étiquetée en phase terminale C est exprimée et purifiée à l’homogénéité d’E.Coli.
Le ballonnement occidental montre que l’augmentation de la concentration de PI (3, 4, 5)P3, mais pas pi(4, 5)P2, inhibe l’interaction du RAP1 recombinant avec pi (3, 4, 5)P3 perles. L’ajout de t.brucei purifié pip5Pase enzyme à la réaction restauré PI (3, 4, 5)P3 liaison par RAP1 recombinant. Ceci est dû à la déphosphorylation PIP5Pase de PI libre(3, 4, 5)P3, et indique ainsi que le modèle de phosphorylation de ce métabolite est essentiel pour notre liaison RAP1.
Les protéines T.brucei qui se lient à Ins(1, 4, 5)P3 sont ensuite identifiées par chromatographie par affinité suivie d’une spectrométrie de masse. L’analyse SDS-PAGE montre l’enrichissement des protéines édulcées d’Ins(1, 4, 5)P3 perles, par rapport aux protéines élitées des perles d’agarose de contrôle. L’analyse de spectrométrie de masse des protéines éléfugées a identifié plus de 250 protéines dont 84 ont été enrichies en perles Ins(1, 4, 5)P3, comparativement aux perles de contrôle.
L’enrichissement des protéines liées à Ins(1, 4, 5)P3, par rapport aux perles de contrôle, est corrélé avec le signal protéique détecté par SDS-PAGE. Une étape essentielle de ce protocole est l’utilisation de contrôles appropriés, afin de discriminer spécifiquement les interactions non spécifiques. Nous recommandons d’utiliser des perles d’agarose non conjuguées et des perles conjuguées au phosphate d’inositol ou aux phosphoinositides, en utilisant diverses configurations phosphatées, y compris des formes non phosphorylatées.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres parasites protozoaires unicellulaires, tels que Trypanosoma cruzi, leishmania, ou plasmodium. Il peut également être facilement adapté à d’autres organismes, y compris la levure ou les cellules mammifères. Cette méthode peut être couplée à la spectrométrie quantitative de masse, telle que SILAC, pour identifier les interactions dynamiques des protéines avec le phosphate d’inositol ou les phosphoinostides.
Dans peut également être combiné avec la fractionnement subcellulaire, pour identifier les protéines spécifiques organites qui se lient à ces métabolites. Cette approche a permis d’identifier les protéines qui se lient au phosphate d’inositol et aux phosphoinositides dans le T.brucei, les cellules mammifères et la levure. Il a permis d’identifier de nouveaux domaines protéiques qui se lient aux phosphoinositides.
Il a ouvert la voie à la comprendre la fonction réglementaire de ces métabolites, leur rôle dans l’expression des gènes, le développement cellulaire et la transduction du signal chez les eucaryotes. Certains des reagents de ce protocole sont toxiques ou inflammables. Utilisez de l’équipement de protection individuelle et, au besoin, travaillez dans un capot à fumée.
