Il fosfato di inositolo e i fosfoinositi sono metaboliti che hanno diverse funzioni regolatorie negli eucarioti, tra cui il controllo dell'espressione genica, il traffico proteico, la trasduzione del segnale e lo sviluppo cellulare. Svolgono queste funzioni regolatorie legandosi alle proteine, cambiando così la conformazione proteica, l'attività catalitica o le interazioni proteiche. L'identificazione delle proteine che si legano al fosfato di inositolo o ai fosfoinositi è essenziale per capire come questi metaboliti svolgono la loro funzione regolatoria.
Questo protocollo ha un flusso di lavoro semplice che è sensibile, non radioattivo, privo di liposome e utilizza reagenti disponibili in commercio. In questo metodo, una cromatografia finita con fosfato di inositolo biotinilato o fosfoinositide, viene utilizzata per isolare le proteine interagenti, vengono quindi identificate dalla macchia occidentale, o spettrometria di massa. Per le forme del flusso sanguigno, far crescere le cellule T.brucei fino alla fase media del log nei supporti HMI-9, integrata con 10%FBS, a 37 gradi Celsius, con 5%Anidride carbonica.
Mantenere la densità cellulare tra 800.000 e 1,6 milioni di cellule per millilitro. Quando è pronto, centrifugare le cellule a 1600 volte G e a temperatura ambiente per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet in 10 milliletre di PBS-G preriscaldato a 37 gradi Celsius per lavare le cellule.
Centrifugare le cellule a 1600 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti per completare il lavaggio. Ripetere questa procedura di lavaggio altre due volte. Quindi rimospend il pellet in un millilitro di PBS-G.
Trasferire questa sospensione su un tubo da un punto cinque millilitri, quindi centrifugare a 1600 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in zero punti cinque millilitri di tampone di lisi, integrati con un cocktail inibitore della proteasi x punto cinque, e un cocktail inibitore della fosfatasi X che è stato pre-refrigerato sul ghiaccio per lisciviare le cellule. Centrifugare il lysate a 1400 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo questo raccogliere il supernatante, che contiene le proteine parassitarie estratte, in un nuovo tubo millilitro di un punto cinque per i test di legame. Accantonare il 5% del lysate totale per l'analisi western blot. Raccogliere 50 microlitri di fosfati di inositolo o fosfoinositi coniugati a perline di agarosio e aggiungerli a 500 millilitri di tampone legante.
Centrifuga a 1000 volte G per un minuto. Scartare il supernatante e resospend in 50 microlitri di tampone di legame per equilibrare le perline. Usa perline non coniugate come controllo e usa perline con diverse configurazioni fosfate tra cui forme non fosforilate, per controllare le interazioni non specifiche.
Successivamente, aggiungere 50 microlitri di perline IP o PI al litolato cellulare o alle proteine purificate. Mantenere il volume delle perline entro il 10% del lysate totale. Se necessario, utilizzare il buffer di associazione per regolare il volume della reazione di associazione.
Incubare la reazione per un'ora o durante la notte a quattro gradi Celsius, mentre si ruota a 50 rpm. Dopo questo, centrifuga il mix a 1000 volte G e a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere il supernatante e conservare il pellet, assicurandosi di mantenere il 5% del supernatante per l'analisi western blot.
Quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio e toccare o ruotare il tubo per rimospendare la resina. Centrifugare la reazione a 1000 volte G, e a quattro gradi Celsius per un minuto, e scartare il supernatante. Ripetere questo processo per un totale di cinque lavaggi.
Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone 2X Laemmli integrati con 710 millimolare 2-mercaptoetanolo alle perline. Toccare o vortice per mescolare e diluire le proteine. Successivamente, riscaldare a 95 gradi Celsius per cinque minuti e centrifugare a 10.000 volte G per un minuto.
Raccogliere il supernatante, e congelare l'eluato a meno 80 gradi Celsius, o procedere all'analisi western macchia. Il metodo qui presentato viene utilizzato per analizzare il legame dei PI mediante proteina repressore-attivatore 1 dal lisato T.brucei, o dalla proteina repressore-attivatore T.brucei ricombinante 1 proteina. Poiché rap1 manca di domini di legame PI canonici, i test di legame vengono eseguiti con PI non fosforilati, o che sono fosforilati in diverse posizioni dell'anello inositolo e con perline di agarosio non coniugate.
L'analisi occidentale mostra che RAP1 si lega preferenzialmente alle perle PI(3, 4, 5)P3, ma che si lega anche in misura minore alle perle PI(4, 5)P2. Tuttavia, non si è legato ad altri IPI o perline di agarosio. Per verificare se RAP1 si lega direttamente ai PI, una proteina RAP1 ricombinante 6XHis con tag terminale C è espressa e purificata all'omogeneità da E.Coli.
L'gonfiore occidentale mostra che l'aumento della concentrazione di PI(3, 4, 5)P3, ma non PI(4, 5)P2, inibisce l'interazione del RAP1 ricombinante con le perline PI(3, 4, 5)P3. L'aggiunta dell'enzima PIP5Pasi purificato T.brucei alla reazione ripristinata pi(3, 4, 5)P3 legante dal ricombinante RAP1. Ciò è dovuto alla defosforilazione PIP5Pasi di PI libero(3, 4, 5)P3, e quindi indica che il modello di fosforilazione di questo metabolita è essenziale per il nostro legame RAP1.
Le proteine T.brucei che si legano a Ins(1, 4, 5)P3 sono quindi identificate dalla cromatografia di affinità seguita dalla spettrometria di massa. L'analisi SDS-PAGE mostra l'arricchimento in proteine eluite dalle perle Ins(1, 4, 5)P3, rispetto alle proteine eluite dalle perle di agarosio di controllo. L'analisi della spettrometria di massa delle proteine eluite ha identificato oltre 250 proteine di cui 84 arricchite con perline Ins(1, 4, 5)P3, rispetto alle perline di controllo.
L'arricchimento delle proteine legate a Ins(1, 4, 5)P3, rispetto alle perline di controllo, è correlato al segnale proteico rilevato da SDS-PAGE. Un passaggio critico di questo protocollo è l'uso di controlli appropriati, per discriminare interazioni specifiche da interazioni non specifiche. Si consiglia di utilizzare perline di agarosio non coniugate e perline coniugate con fosfato di inositolo o fosfoinositi, utilizzando varie configurazioni fosfate, comprese le forme non fosforilate.
Questo metodo può essere applicato ad altri parassiti protozoici unicellulari, come Trypanosoma cruzi, leishmania o plasmodium. Può anche essere facilmente adattato ad altri organismi, tra cui lievito o cellule di mammiferi. Questo metodo può essere accoppiato alla spettrometria quantitativa di massa, come il SILAC, per identificare le interazioni dinamiche delle proteine con fosfato inositolo o fosfoinostidi.
In può anche essere combinato con il frazionamento subcellulare, per identificare proteine specifiche organelle che si legano a questi metaboliti. Questo approccio ha aiutato a identificare le proteine che si legano al fosfato di inositolo e ai fosfoinositi in T.brucei, cellule di mammifero e lievito. Ha aiutato a identificare nuovi domini proteici che si legano ai fosfoinositidi.
Ha spianato la strada alla comprensione della funzione regolatore di questi metaboliti, del loro ruolo nell'espressione genica, nello sviluppo cellulare e nella trasduzione del segnale negli eucarioti. Alcuni dei reagenti di questo protocollo sono tossici o infiammabili. Utilizzare dispositivi di protezione individuale e, se necessario, lavorare in una cappa aspirante.
