肌醇磷酸盐和磷酸磷酸是代谢物，在真核生物中具有多种调节功能，包括控制基因表达、蛋白质贩运、信号转导和细胞发育。它们通过与蛋白质结合来执行这些调节功能，从而改变蛋白质的构象、催化活性或蛋白质相互作用。识别与磷酸肌醇或磷酸西肽结合的蛋白质对于了解这些代谢物如何执行其调节功能至关重要。
该协议具有一个简单的工作流程，是敏感，非放射性的，无光体，并使用商业上可用的试剂。在这种方法中，用生物基化肌醇磷酸盐或磷酸酯完成色谱，用于分离相互作用的蛋白质，然后由西方印迹或质谱仪识别。对于血流形式，在HMI-9介质中将T.brucei细胞生长到中生期，辅以10%FBS，温度为37摄氏度，二氧化碳含量为5%。
保持细胞密度在80万到160万细胞每毫升之间。准备就绪后，在1600倍G下将细胞离心，在室温下离心10分钟。丢弃上一液，轻轻将颗粒重新在 10 毫安的 PBS-G 中，在 37 摄氏度下预热，以清洗细胞。
在 1600 倍 G 和室温下将细胞离心五分钟，以完成洗涤。再重复两次此洗涤程序。然后将颗粒重新在一毫升PBS-G中重新暂停。
将此悬浮液转移到一点五毫升管，然后在 1600 次 G 下离心五分钟。丢弃上流剂，将颗粒重新在零点五毫升的解液缓冲液中，辅以一点五 X蛋白酶抑制剂鸡尾酒，以及一种在冰上预冷却的X磷酸酶抑制剂鸡尾酒，以解液细胞。在1400倍G和4摄氏度下离心10分钟。
在此收集上清液，其中含有提取的寄生虫蛋白，到一个新的一点五毫升管结合测定。留出5%的总莱酸盐用于西部印迹分析。收集50微升的肌醇磷酸盐或磷酸西肽结合到琼糖珠，并添加他们500毫升的结合缓冲液。
在 1000 倍 G 下离心一分钟。丢弃上流水，重新在50微升的结合缓冲器中平衡珠子。使用非偶联珠作为控制，并使用具有不同磷酸盐配置的珠子（包括非磷酸化形式）来控制非特异性相互作用。
接下来，在细胞糖酸盐或纯化蛋白质中加入50微升IP或PI珠。将珠子的体积控制在总落酸的10%以内。如有必要，使用绑定缓冲器调整绑定反应的体积。
在4摄氏度下孵育反应一小时或过夜，同时以50rpm旋转。在此之后，将混合物在1000倍G下离心，在4摄氏度下离心1分钟。取出上一液，并保留颗粒，确保保持5%的上半液进行西印分析。
然后加入一毫升的洗涤缓冲液，然后敲击或旋转管子以重新暂停树脂。在1000倍G下离心反应，在4摄氏度下离心1分钟，然后丢弃上一代。重复此过程，总共进行五次洗涤。
在此之后，加入50微升的2X莱姆利缓冲液，并辅以710毫摩尔2-甲醇到珠子。点击或涡流混合，稀释蛋白质。接下来，在95摄氏度下加热5分钟，在10，000次G下离心1分钟。
收集上一液，或在零下80摄氏度冻结水线，或进行西部印迹分析。本文介绍的方法用于分析从T.brucei赖解物的抑制剂活化蛋白1或重组T.brucei抑制剂-活化蛋白1蛋白的PI结合。由于 RAP1 缺乏规范 PI 绑定域，结合测定使用非磷酸化的 PI 执行，或在肌醇环的不同位置进行磷酸化，以及使用非结合的琼糖珠进行。
西方分析表明，RAP1优先绑定到PI（3，4，5）P3珠子，但它也绑定到PI（4，5）P2珠子的程度较小。然而，它并没有绑定到任何其他PI或红玫瑰珠。为了测试RAP1是否直接与PI结合，从E.Coli将表达并纯化为均匀性C端标记的6XHis重组RAP1蛋白。
西方印迹表明，增加PI（3，4，5）P3的浓度，但不是PI（4，5）P2，抑制重组RAP1与PI（3，4，5）P3珠的相互作用。T.brucei纯化PIP5Pase酶加入反应恢复PI（3，4，5）P3结合重组RAP1。这是因为PIP5Pase脱磷脱磷基的免费PI（3，4，5）P3，因此表明这种代谢物的磷酸化模式是必不可少的，我们的RAP1结合。
与 Ins（1，4，5）P3 结合的 T.brucei 蛋白随后通过亲和色谱法进行识别，然后进行质谱法测定。SDS-PAGE分析显示，从因斯（1，4，5）P3珠子中分出的蛋白质富含，而从控制糖珠中分出的蛋白质则具有丰富的含量。与控制珠相比，对发现超过250种蛋白质的洗样蛋白质进行质谱分析，其中84种蛋白质富含因斯（1、4、5）P3珠。
与控制珠相比，与 Ins（1、4、5）P3 结合的蛋白质的富集与SDS-PAGE检测到的蛋白质信号相关。此协议的一个关键步骤是使用适当的控件，以区分特定和非特定交互。我们建议使用非偶联琼珠，使用与肌醇磷酸盐或磷酸酯结合的珠子，使用各种磷酸盐配置，包括非磷酸化形式。
此方法可应用于其他单细胞原生动物寄生虫，如锥虫瘤、利什曼病或疟原虫。它也可以很容易地适应其他生物体，包括酵母或哺乳动物细胞。此方法可与定量质谱法（如SILAC）耦合，以识别蛋白质与磷酸肌醇或磷酸酶的动态相互作用。
在中也可以与亚细胞分馏相结合，以识别与这些代谢物结合的细胞器特异性蛋白质。这种方法有助于识别与磷酸肌醇和磷酸磷酸酶结合的蛋白质，包括哺乳动物细胞和酵母中的磷酸磷酸盐。它帮助识别了与磷脂结合的新蛋白质域。
它为了解这些代谢物的调控功能、它们在基因表达、细胞发育和真核生物信号转导中的作用铺平了道路。该协议中的一些试剂是有毒的，或易燃的。使用个人防护设备，必要时在烟罩中工作。
