إن توليد النماذج الخلوية الأولية أو الهياكل الشبيهة بالعضية هو المفتاح للإجابة على العديد من الأسئلة المعاصرة في علم الأحياء. على سبيل المثال، لقد كنا مهتمين لبعض الوقت في الآليات المستخدمة من قبل الفيروسات البشرية لتسهيل النسخ المتماثل في الغدة اللعابية كما هو موقع مهم لانتقال أفقي. إن تطوير النظام القائم على الساليزفير الموصوف في هذا البروتوكول هو تقدم حاسم في سعينا للإجابة على هذه الأنواع من الأسئلة.
هذه التقنية تسمح لنا لتوليد الخلايا الأولية من مجموعة متنوعة من عينات المرضى المختلفة. النماذج الخلوية هي أكثر تذكرنا في حالة نوع الجسم الحي كما لا يتم على غرار الخلايا أو تحويل مثل العديد من أنواع الخلايا المستخدمة عادة للتجارب في المختبر. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لتوليد خلايا مماثلة من الماوس الغدة تحت الثانوية الأولية والبروتوكول من المرجح أن تكون مفيدة للأعضاء الأخرى مع هياكل الخلوية مماثلة.
في غضون ساعتين إلى أربع ساعات بعد الإزالة من المريض ، على طبق الثقافة ، استخدم مقص تشريح معقم ومعقم جراحيًا لفرم أنسجة الغدة اللعابية إلى قطع دقيقة بحجم ملليمترين إلى مترين. أضف ستة ملليلترات من محلول Dispase/Collagenase إلى الأنسجة المفرومة. ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
تعطيل الأنسجة عن طريق الأنابيب مع ماصات المصلية ملليلتر خمسة 15 إلى 20 مرة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إلى ساعة واحدة. كرر خطوة الأنابيب والاحتضان مرتين إلى ثلاث مرات أخرى أو حتى يشبه النسيج الطين ويمكن أن تمر بسهولة من خلال فتح ماصة.
لمعطف الآبار مع BMM، ماص ببطء 500 ميكرولتر من بين عشية وضحاها ذاب BMM في كل بئر من لوحة ستة بئر. ببطء دوامة لوحة لتوزيع بالتساوي BMM على الآبار. ثم احتضان لوحات المغلفة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخدامها للسماح لBMM لترسيخ.
أولاً، نقل محلول Dispase/Collagenase الذي يحتوي على أنسجة متجانسة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. اغسل جدار اللوحة مرة واحدة بستة ملليلترات من DPBS لنقل الخلايا المتبقية إلى الأنبوب المخروطي. ثم من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون سعة 70 ميكرومتر، قم بتصفية المتجانسات في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر لإزالة الأنسجة غير المهضومة.
خلايا جهاز طرد مركزي متوترة لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز. استلهموا المُنطّع. ثم resuspend بيليه الخلية في 10 ملليلتر من 1X RBC تحلل العازلة.
احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. ثم إضافة 20 إلى 25 ملليلتر من DPBS لتحييد العازلة تحلل RBC وتقليل تحلل الخلايا اللعابية. أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز.
أبيض بيليه الخلية يشير إلى تحلل كامل من جميع RBC. إذا كان بيليه لديه اللون الأحمر، وتكرار العلاج مع عازلة تحلل RBC. التعرق وssuspend بيليه في ملليلتر واحد إلى اثنين من BEGM ومن ثم نقل الخلايا resuspended على الآبار المغلفة BMM.
احتضان في 37 درجة مئوية. مرة واحدة مطلية على BMM، سوف تتشكل الخلايا في هياكل كروية أو salispheres على مدى فترة 2-3 أيام. يمكن الحفاظ على الخلايا كساليزفير لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل أن يبدأ BMM في التحلل مما يسمح للخلايا بالوصول إلى البلاستيك والتمسك به والنمو كطبقات أحادية.
أولاً، تُشعّب الوسائط من الآبار وتضيف ملليًا واحدًا من حل Dispase/Collagenase لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا أو حتى BMM قد حل في الغالب. ثم نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وغسل الآبار مرة واحدة مع ملليلتر واحد إلى ثلاثة من DPBS للحصول على الخلايا المتبقية.
أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز. التعرق وssuspend بيليه في مليلتر اثنين من تريبسين. احتضان مرة أخرى في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
المقبل، إضافة إلى أنبوب أي وسائل الإعلام كاملة تحتوي على 10٪ مصل لتحييد تريبسين. أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز. التعرق لإزالة الوسائط المتبقية، التربسين والمصل ومن ثم إعادة فرض الخلايا في DPBS.
أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز. التعرق وssuspend بيليه في BEGM. للحفاظ على بيليه وكرات، لوحة الخلايا resuspended على أطباق الثقافة المغلفة BMM الصلبة.
ثقافة جميع الخلايا في حاضنة مرطبة حافظت على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل دون الترطيب. تتغذى مع BEGM الطازجة كل يومين إلى ثلاثة أيام. لنشر الخلايا كطبقة أحادية على أطباق الثقافة البلاستيكية ، تُفطّن وسائل الإعلام BEGM من الطبق وتغسل مرة واحدة مع DBPS لإزالة الوسائط المتبقية.
إضافة مليلتر من تريبسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى الخلايا قد فصل تماما. تحييد تريبسين باستخدام أربعة ملليلتر من أي وسائل الإعلام كاملة تحتوي على 10٪ مصل. ثم إمالة بلطف الطبق ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
اغسل الطبق مرة واحدة مع حوالي خمسة ملليلترات من DPBS لجمع الخلايا المتبقية. أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز. استلهموا المُنطّع.
لإزالة الوسائط المتبقية، إعادة تعليق الخلايا في 6 إلى 10 ملليلتر من DPBS. أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 500 مرة ز. الطامح المابير و resuspend في BEGM.
ثم قم بطبقة الخلايا على أطباق ثقافة الأنسجة البلاستيكية المعالجة. ثقافة الخلايا في حاضنة مرطبة حافظت على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل دون الترطيب. تتغذى مع BEGM الطازجة كل يومين إلى ثلاثة أيام.
في هذا البروتوكول، بعد طلاء الخلايا من الأنسجة المهضولة على BMM لمدة يومين إلى ثلاثة أيام، شكلت الخلايا بسهولة مجموعات صغيرة استمرت في التوسع في حجم يصل إلى 15 إلى 20 خلية لكل كتلة. كانت خلايا ساليزفير مطلية على الخلايا المزروعة بالبلاستيك المعالج ونمت كطبقة أحادية حيث تظهر مورفولوجيا تتفق مع الخلايا ذات الأصل الظهاري. هناك حاجة إلى تقنية معقمة مناسبة ورعاية لتجنب التلوث البكتيري أو الفطري.
لن توفر أي كمية من المضادات الحيوية أو مضادات الميكواتيك ثقافة تعج بالميكروبات. نحن نجيب على أسئلة حول التسبب الفيروسي وانتقال العدوى. ولكن بالنسبة للآخرين، وهذا يوفر وسيلة لدراسة الخلايا اللعابية البشرية لأي عدد من التطبيقات مثل علاجات تجديد الأنسجة.
بالنسبة لنا الذين يدرسون فيروس الخلايا المضخمة البشرية، سمحت لنا هذه التقنية بالبدء في استكشاف الآليات الجزيئية التي يستخدمها الفيروس لإصابة المضيفين الجدد ونقلها في نهاية المطاف. لا شيء يستخدم في هذا البروتوكول هو بطبيعته خطرة ولكن ينبغي دائما توخي الحذر عند التعامل مع الأنسجة البشرية وأي نوع من الكواشف الكيميائية.
