يوضح هذا البروتوكول طريقة محسنة لشراء خلايا ظهارية أسنان بشرية. من الصعب تحديد بيليه الخلية المجمعة أثناء الإجراءات. كن حذرا عند التعامل مع supernatant لمنع فقدان مجموعات الخلايا.
للبدء، حصاد بصيلات الأسنان أثناء الاستخراج الجراحي من الأضراس الثالثة المتضررة. بدء إجراءات عزل الخلايا أو تخزين بصيلات الأسنان في أربع درجات مئوية في DPBS مع 3٪ البنسلين-streptomycin. لغسل بصيلات الأسنان، أمسك بصيلات الأسنان بالملاقط ووضعها في أنبوب الغسيل 1.
يهز بلطف 10 إلى 15 مرة. أخرجه وضعه في الأنبوب 2. مرة أخرى، يهز 10 إلى 15 مرة.
وأخيرا، أخرجه وضعه في الأنبوب 3، ثم هزه. بعد الغسيل ثلاث مرات، ضع بصيلات الأسنان في طبق ثقافة 60 ملليمتر. فرم الأنسجة بمقص الأنسجة حتى بصيلات الأسنان له مظهر اللب أو اسفنجي.
استخدم قسما جانبيا صغيرا من طبق الثقافة لتقليل فقدان الأنسجة. مزيج ملليلتر واحد كل من كولاجيناز نوع 1 ومحلول بروتياز في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. نقل الأنسجة المفرومة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، ثم يهز بلطف واحتضانه لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
إضافة خمسة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الأنبوب. يهزه ويحتضن لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. إعداد الكيراتينوسيت المتوسطة التي تحتوي على الكيراتينوسيت مصل خالية من المتوسطة و 10٪ مصل البقر الجنين.
إضافة ثلاثة ملليلتر من الكيراتينية المتوسطة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر جديدة. ضع مصفاة 40 ميكرومتر فوق هذا الأنبوب. بعد ذلك ، يستنشق الفائق من الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة مع ماصة مصلية 10 ملليلتر وتمريرها من خلال مصفاة.
نقل تعليق جمعها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. طرد مركزي الأنبوب وإزالة supernatant. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من الكيراتينوسيت وسيط خال من المصل.
الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق أخرى وإزالة supernatant. لوحة السكان خلية واحدة في طبق ثقافة 60 ملليمتر باستخدام وسيلة خالية من مصل الكيراتينية. الحفاظ على طبق الثقافة مع حجم النهائي من خمسة ملليلتر في جو مرطب من ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية.
ظهرت خلايا ذات مورفولوجيا ظهارية في غضون سبعة إلى عشرة أيام بعد طلاء مجموعات خلايا واحدة. وتراوح عدد الخلايا الظهارية المرصوفة بالحصى من 1 إلى 10 في وقت ظهورها وتوسعت الخلايا إلى مستعمرات مع مرور الوقت. الخطوة الأكثر أهمية هي قطع بصيلات الأسنان إلى جزيئات صغيرة.
أنه يعزز فصل خلايا واحدة من أنسجة الجريبات. يمكن عزل الخلايا الميكنشيمالية من بصيلات الأسنان البشرية. المصل الذي يحتوي على بيئة الثقافة يختار الخلايا الميكنشيمالية ويمنع النمو الظهاري من مجموعات الخلايا المفردة.
يوفر هذا البروتوكول طريقة شراء الخلايا الظهارية أسنان الإنسان. يمكن استخدام الخلايا الظهارية المشتقة من بصيلات الأسنان لدراسة التفاعلات الظهارية الظهارية للأسنان.
