Birincil hücresel modeller veya organoid benzeri yapılar üretmek biyolojideki birçok güncel soruyu yanıtlamanın anahtarıdır. Örneğin, yatay iletim için önemli bir site olduğu gibi tükürük bezi çoğaltma kolaylaştırmak için insan virüsleri tarafından kullanılan mekanizmalar oldukça uzun bir süre ilgi oldum. Bu protokolde tanımlanan salya temelli sistemin gelişimi, bu tür sorulara cevap verme arayışımızda çok önemli bir ilerlemedir.
Bu teknik bize farklı hasta örnekleri çeşitli birincil hücreleri oluşturmak için izin verir. Hücreler in vitro deneyler için yaygın olarak kullanılan birçok hücre tipi gibi modellenmiş veya dönüştürülmüş değil gibi hücresel modeller in vivo tipi durumu daha anımsatır. Bu protokolü fare nin birincil submandibular bezinden benzer hücreler üretmek için kullandık ve protokol benzer hücresel yapılara sahip diğer organlar için de yararlı olacaktır.
Hastadan alındıktan sonra 2-4 saat içinde, bir kültür plakası üzerinde, otoklavlı sterildiksiyon makası ve cerrahi forceps kullanarak tükürük bezi dokusunu 1-2 milimetre büyüklüğünde ince parçalara ayırın. Kıyma doku dispase / Kollajenaz çözeltisi altı mililitre ekleyin. Sonra 37 derecede yaklaşık 30 dakika ile bir saat arasında kuluçkaya yat.
Beş mililitrelik serolojik pipet ile 15-20 kez pipetleme ile dokuyu bozun. 37 derecede 30 dakika ile bir saat arasında kuluçkaya yat. Pipetleme ve kuluçka adımını 2-3 kez daha veya doku bir bulamaç benzeyene ve pipet açıklığından kolayca geçene kadar tekrarlayın.
BMM ile kuyukaplamak için, yavaş yavaş pipet 500 mikrolitre gecede çözülmüş BMM altı kuyu nun her kuyuiçine. BmM'i kuyuların üzerine eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça döndürün. Daha sonra bmm katılaşmak için izin kullanmadan önce en az 15 dakika boyunca 37 santigrat derece de kaplamalı plakalar kuluçka.
İlk olarak, homojendoku içeren Dispase/Kollajenaz çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri konik tüpe aktarmak için altı mililitre DPBS ile plakanın duvarını bir kez yıkayın. Sonra 70 mikrometre naylon örgü hücre süzgeci ile, sindirilmemiş doku kaldırmak için yeni bir 50 mililitre konik tüp içine homojen filtre.
Santrifüj 500 kez g beş dakika boyunca hücreleri gergin. Süpernatant aspire. Daha sonra hücre peletini 1X RBC lysis tamponunun 10 mililitresinde yeniden askıya alın.
37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yat. Daha sonra RBC lysis tampon nötralize etmek ve tükürük hücrelerinin lysis en aza indirmek için DPBS 20 ila 25 mililitre ekleyin. 500 kez g beş dakika santrifüj.
Beyaz hücreli pelet tüm RBC'nin tam bir lizini gösterir. Pelet kırmızı renktedir, RBC lysis tamponu ile tedaviyi tekrarlayın. Supernatant aspire ve BEGM bir ila iki mililitre pelet resuspend ve daha sonra BMM kaplı kuyular üzerine resuspended hücreleri aktarın.
37 santigrat derecede kuluçkaya yat. BmM'e bulaştığında hücreler iki ila üç günlük bir süre içinde küresel yapılara veya salyalara dönüşürler. Hücreler, BMM'in hücrelere erişmesine ve plastiğe yapışmasına ve tek katmanlı olarak büyümesine izin vererek bozulmaya başlamasından önce yaklaşık beş ila yedi gün boyunca salya olarak tutulabilir.
İlk olarak, kuyulardan medya aspire ve her kuyu ya Dispase / Kollajenaz çözeltisi bir mililitre ekleyin. Yaklaşık 15 dakika veya BMM çoğunlukla eriyene kadar 37 santigrat derecede kuluçka. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve kalan hücreleri elde etmek için bir ila üç mililitre DPBS ile kuyuları yıkayın.
500 kez g beş dakika santrifüj. Supernatant aspire ve Trypsin iki mililitre pelet resuspend. 15 dakika boyunca 37 derecede tekrar kuluçkaya yat.
Daha sonra, Trypsin nötralize etmek için% 10 serum içeren herhangi bir tam medya tüp ekleyin. 500 kez g beş dakika santrifüj. Artık ortam, Tripsin ve serumu çıkarmak ve DPBS'deki hücreleri yeniden askıya almak için süpernatantı aspire edin.
500 kez g beş dakika santrifüj. Supernatant aspire ve BEGM pelet resuspend. Peletküre olarak korumak için, katılaşmış BMM kaplı kültür yemekleri üzerine resuspended hücreleri plaka.
Kültür nemlendirilmiş bir kuluçka makinesindeki tüm hücreler 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile beş ila yedi gün önce subculturing ile muhafaza. Her 2-3 günde bir taze BEGM ile besleyin. Hücreleri plastik kültür tabaklarına tek katmanlı olarak çoğaltmak için, BEGM ortamını yemekten aspire edin ve artık ortamı kaldırmak için bir kez DBPS ile yıkayın.
15 dakika veya hücreler tamamen ayrılmış olana kadar 37 santigrat derece iki mililitre tripsin ve kuluçka ekleyin. % 10 serum içeren herhangi bir tam medya dört mililitre kullanarak Tripsin nötralize. Sonra yavaşça çanak eğmek ve 15 mililitrekonik tüp hücreleri aktarın.
Kalan hücreleri toplamak için yaklaşık beş mililitre DPBS ile plakayı bir kez yıkayın. 500 kez g beş dakika santrifüj. Süpernatant aspire.
Kalan ortamları kaldırmak için, altı ila 10 mililitre DPBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. 500 kez g beş dakika santrifüj. BeGM'de supernatant'ı aspire edin ve yeniden askıya alın.
Sonra tedavi plastik doku kültür yemekleri üzerine hücreleri plaka. Kültür nemlendirilmiş bir kuluçka makinesindeki hücreler, subküle atılından beş ila yedi gün önce %5 karbondioksitle 37 derecede muhafaza edilir. Her 2-3 günde bir taze BEGM ile besleyin.
Bu protokolde, sindirilmiş dokudaki hücreleri 2-3 gün bmm'e kaplamasından sonra, hücreler küme başına 15 ila 20 hücreye kadar boyut genişletmeye devam eden küçük kümeler oluşturdular. Salya hücreleri hücre kültürlü işlenmiş plastik üzerine kaplanmış ve epitel kökenli hücreler ile tutarlı morfolojisi sergileyen bir monolayer olarak yetiştirilen. Bakteriyel veya mantar kontaminasyonunu önlemek için uygun aseptik teknik ve bakıma ihtiyaç vardır.
Antibiyotik veya antimikotik hiçbir miktar mikroplar ile dolu bir kültür kaydedecektir. Viral patogenez ve bulaşma ile ilgili soruları yanıtlıyoruz. Ama diğerleri için, bu doku rejenerasyon tedavileri gibi uygulamaların herhangi bir sayı için insan tükürük hücreleri çalışma için bir yol sağlar.
İnsan Cytomegalovirüs çalışma bizim için, bu teknik bize virüs enfekte ve sonuçta yeni konaklara iletmek için kullandığı moleküler mekanizmaları keşfetmeye başlamak için izin verdi. Bu protokolde kullanılan hiçbir şey doğal olarak tehlikeli değildir ancak insan dokusu nu ve her türlü kimyasal reaktifi kullanırken her zaman dikkatli olunmalıdır.
