يسهل هذا البروتوكول التحليلات الكمية الصغيرة إلى الكبيرة لمحتوى الدهون في التخزين الخلوي في مجموعة متنوعة من أنواع الخميرة ويقوم بذلك بطريقة غير متحيزة وموحدة. وتسمح هذه التقنية بالتجهيـز السريع للصور المجهرية وتوفر مخرجات كمية مفصلة لمقارنة العينات بسهولة مثل مختلف المسوخ والخلايا التي تزرع في ظل ظروف متنوعة. لتبدأ، اتبع على طول في بروتوكول النص المصاحب لإعداد حلول تلطيخ، وسائل الإعلام والثقافة، والخلايا.
تأكد من أن الخلايا صحية وفي مرحلة النمو المطلوبة قبل تشغيل التجربة. بعد ذلك، قم بإعداد غطاء مجهري لكل عينة ليتم تصويرها. انتشار ميكرولتر واحد من حل طلاء الشريحة على غطاء نظيف باستخدام الجانب الطويل من طرف ماصة وضع أفقيا.
السماح للطلاء حل لتجف تماما، ومن ثم تخزين الأغطية في بيئة خالية من الغبار. بعد ذلك، قم بقياس الكثافة البصرية لثقافات الخلايا، ولكي يتم تحليل الثقافات في نفس مرحلة النمو، حاول الوصول إلى قيم مماثلة بين جميع الثقافات المختبرة لضمان ظروف تجريبية قابلة للمقارنة. ثم، ماصة ملليلتر واحد من ثقافة الخلية في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
بالنسبة لخلايا S.cerevisiae فقط، أضف خمسة ميكروليتر من حل طلاء الشريحة إلى الأنبوب أيضًا. ثم، دوامة لفترة وجيزة كل من أنابيب microcentrifuge، واحتضان لهم في 30 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من حل تلطيخ الدهون لكل aliquot الثقافة، ودوامة لهم لفترة وجيزة.
ثم، إضافة 10 ميكرولترات من حل التصور حدود الخلية، ودوامة لهم لفترة وجيزة مرة ثانية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 1،000 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء من الغزل، وإزالة 950 ميكرولترات من السوبر و resuspend الخلايا في السوبر المتبقية باستخدام ماصة.
بعد ذلك ، ماصة اثنين من microliters من تعليق الخلية الكثيفة على غطاء المغلفة الليكتين. ثم، ضع الغطاء على شريحة مجهرية نظيفة لتشكيل أحادي الخلية، ثم انتقل إلى المجهر في أسرع وقت ممكن لتقليل القطع الأثرية في التصوير. يتطلب إعداد المجهر التعرض الطويل لمصادر الضوء القوية التي يمكن أن تسبب تلفًا للعينة والنتائج المنحرفة.
لذلك، قم بإعداد ظروف التصوير باستخدام شريحة عينة مخصصة لن يتم استخدامها بشكل أكبر في القياس الكمي لقطر الدهون. ضع العينة المخصصة على مرحلة إعداد مجهر التباين على النقيض من المرحلة أو التداخل التفاضلي ، وركز على الخلايا. في برنامج المجهر، قم بتعيين إعدادات Z-المكدس بحيث تمتد على حجم الخلية بالكامل.
تعتمد المسافة العمودية الإجمالية على حجم الخلية، ويعتمد عدد الشرائح البصرية على الفتحة العددية للهدف. بعد ذلك، حدد التركيز للانتقال بالنسبة إلى مستوى التركيز المركزي. لصورة قطرات الدهون، تعيين تجريبيا شدة الضوء ووقت التعرض في القناة الخضراء.
كن حذرا عند التصوير، كما BODIPY هو fluorochrome مشرق جدا التي قد تكون سريعة photobleached. بالإضافة إلى ذلك، تقليل وقت التعرض لتجنب التشبع المفرط. التقاط كامل قناة خضراء Z-المكدس أولا قبل التحول إلى القناة الزرقاء لمنع طمس قطرات الدهون المحمولة.
إلى حدود الخلية الصورة، تعيين تجريبيا شدة الضوء ووقت التعرض في القناة الزرقاء. إن أمكن، قم بإعداد واستخدام سير عمل تجريبي آلي في برنامج التحكم بالمجهر لتسهيل تصوير عينات متعددة في ظل ظروف موحدة. الأهم من ذلك، يجب الحصول على جميع الصور باستخدام نفس الإعدادات للسماح للمقارنة المناسبة بين العينات.
بمجرد تحسين ظروف التصوير، ركز على الخلايا وصورها في كل من القناتين الخضراء والزرقاء. صورة حقول عرض متعددة لكل عينة للحصول على بيانات قوية وتمثيلية. حفظ الصور الزرقاء والأخضر قناة Z المكدس كملفات TIFF متعددة الطبقات 16 بت.
تأكد من تضمين الكلمات الأخضر أو الأزرق في أسماء الملفات المقابلة. افتح الصور المجهرية في ImageJ، وأزل أي رصات صور تحتوي على عدد كبير من الخلايا التي انتقلت أثناء الاستحواذ. هذه تظهر في مواضع مختلفة في أقسام Z الفردية.
بعد ذلك، قم بإزالة أي رصات صور تحتوي على جزيئات غير خلية عالية الفلورسنت في القناة الزرقاء. وغالبا ما يحدث ذلك بسبب الأوساخ على سطح التصوير أو الشوائب في وسط الزراعة وقد تتداخل مع الكشف عن الخلايا في المناطق المجاورة لها. أيضا، إزالة أي مكدسات الصورة التي تحتوي على نسبة كبيرة من الخلايا الميتة.
هذه الصور سوف تعرض الخلايا مع زيادة الفلورس الأزرق مقارنة مع الخلايا الحية. في حين أن وجود عدد قليل من الخلايا الميتة في العينة عادة ليست مشكلة ويتم تجاهل هذه الخلايا تلقائيا أثناء التحليل، قد يتم التعرف أحيانا بعض الخلايا الميتة أو المحتضرة كخلايا حية من قبل خوارزمية التجزئة وبالتالي انحراف النتائج المبلغ عنها. لبدء التحليل في MATLAB ، أولا إنشاء مجلد رئيسي ونسخ جميع البرامج النصية MATLAB لهذا الموقع.
بعد ذلك، إنشاء المجلدات الفرعية مع أسماء أنواع الخميرة المختلفة، ونسخ الصور TIFF المعنية إلى هذه المواقع. الآن، بدء MATLAB، فتح البرنامج النصي MAIN. m، وتشغيل البرنامج النصي.
في القائمة، حدد أنواع الخميرة ليتم تحليلها وبدء معالجة الصور. فحص ومعالجة ملفات الإخراج كما هو مطلوب باستخدام محرر جدول بيانات أو حزمة إحصائية. ينتج سير العمل ملفات CSV مفصولة بفواصل منقوطة وملفات TIFF مجزأة مع كائنات الخلايا التي تم اكتشافها وقطرات الدهون.
تظهر هنا هي البرية من نوع S.pombe الخلايا التي نمت في إما متوسطة YES معقدة أو متوسطة EMM محددة. بالمقارنة مع الخلايا التي تزرع في وسط YES، تم الكشف عن عدد أقل من قطرات الدهون وكثافة تلوين أعلى لكل وحدة من حجم الخلية في وسط EMM. وعلاوة على ذلك، كانت قطرات الدهون الفردية التي تشكلت في المتوسط EMM أكبر وعرض زيادة كثافة تلطيخ الكلي.
هذا يتفق مع النتائج السابقة لزيادة محتوى الدهون المخزنة في الخلايا التي تزرع في EMM. بعد ذلك ، تظهر هذه الصور خلايا S.japonicus من الثقافات الأسية والمحطة المبكرة التي نمت في وسيط YES. وأظهرت الخلايا التي تدخل مرحلة ثابتة انخفاضا ملحوظا في عدد قطرات الدهون لكل وحدة من حجم الخلية في حين أن حجم تطبيع كثافة الفلور الفلوري قطرات الدهون انخفض قليلا بين الشرطين.
وكانت قطرات الدهون في المراحل الأولى من المراحل الثابتة عادة أكبر حجماً بشكل معتدل وكانت كثافة الفلورس الكلية أعلى بشكل معتدل مقارنة بالقطرات من الخلايا المتنامية بشكل كبير. في خلايا S.cerevisiae نمت إلى الطور الأسي مقابل الحطة، تحتوي الخلايا الثابتة على عدد أقل إلى حد ما من قطرات الدهون لكل وحدة من الحجم مقارنة بالخلايا المتنامية بشكل كبير. ومع ذلك ، تضاعفت كثافة الفلورية القطرة التي تم تطبيعها بالحجم تقريبًا.
هذه الزيادة الحادة في المحتوى الكلي من قطرات الدهون يرجع إلى كثافة الفلورانس أعلى بكثير وحجم قطرات الدهون الفردية في المرحلة الثابتة. بعد هذا الإجراء، يمكن تجميع بيانات المخرجات في حزمة إحصائية مثل R لإنشاء مخططات للنتائج الموجزة وإجراء اختبارات إحصائية على أي اختلافات ملحوظة في محتوى قطرات الدهون. من حيث المبدأ، يمكن استخدام خط أنابيب معالجة الصور لتحليل محتوى قطرات الدهون في الكائنات الحية الدقيقة الأخرى أو لتحليل هياكل أخرى شبه نقطة الخلايا.
