Bu protokol, çeşitli maya türlerinde hücresel depolama lipid içeriğinin sayısal küçük ve büyük ölçekli analizlerini kolaylaştırır ve bunu tarafsız ve standart bir şekilde yapar. Bu teknik, mikroskobik görüntülerin hızlı bir şekilde işlenmesine olanak sağlar ve çeşitli mutantlar ve çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler gibi örnekleri kolayca karşılaştırmak için ayrıntılı nicel çıktılar sağlar. Başlamak için, boyama çözümlerini, kültür ortamını ve hücreleri hazırlamak için eşlik eden metin protokolünü uygulayın.
Deneyi çalıştırmadan önce hücrelerin sağlıklı ve istenilen büyüme aşamasında olduğundan emin olun. Ardından, görüntülenecek her örnek için bir mikroskop kapağı hazırlayın. Yatay olarak konumlandırılmış pipet ucunun uzun tarafını kullanarak bir mikrolitre slayt kaplama çözeltisini temiz bir kapak kaymasıüzerine yayın.
Kaplama çözeltisinin tamamen kurumasını bekleyin ve kapakları tozsuz bir ortamda saklayın. Daha sonra, hücre kültürlerinin optik yoğunluklarını ölçün ve aynı büyüme aşamasında analiz edilecek kültürler için, karşılaştırılabilir deneysel koşulları sağlamak için tüm test edilmiş kültürler arasında benzer değerlere ulaşmaya çalışın. Sonra, pipet hücre kültürünün bir mililitre 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine.
Sadece S.cerevisiae hücreleri için, tüpe de slayt kaplama çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Sonra, kısaca tüm mikrosantrifüj tüpleri girdap, ve beş dakika sallayarak 30 santigrat derece onları kuluçka. Daha sonra, her kültür aliquot lipid boyama çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve kısa bir süre onları girdap.
Daha sonra, hücre sınır görselleştirme çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin ve onları kısa bir süre ikinci kez girdap. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 1,000 kez yerçekimi santrifüj ederek toplayın. İpliği bittiğinde, supernatant'tan 950 mikrolitre çıkarın ve bir pipet kullanarak kalan süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın.
Sonra, pipet lektin kaplı bir kapak üzerine yoğun hücre süspansiyon iki mikrolitre. Daha sonra, bir hücre monokatmanı oluşturmak için temiz bir mikroskop slayt üzerine coverslip yerleştirin ve görüntüleme eserler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk mikroskopi devam edin. Mikroskobun kurulması, numuneye zarar verebilecek ve sonuçları çarpıtabilecek güçlü ışık kaynaklarına uzun süre maruz kalma gerektirir.
Bu nedenle, lipid damlacık nicelleştirme için daha fazla kullanılmayacak özel bir örnek slayt kullanarak görüntüleme koşulları ayarlayın. Özel örneği faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrast mikroskop kurulumu aşamasına yerleştirin ve hücrelere odaklanın. Mikroskobun yazılımında, Z-stack ayarlarını tüm hücre hacmine yayılabilecek şekilde ayarlayın.
Toplam dikey uzaklık hücre boyutuna bağlıdır ve optik dilimlerin sayısı hedefin sayısal diyafram bağlıdır. Ardından, merkezi odak düzlemine göre hareket etmek için odak ayarlayın. Lipid damlacıklarını görüntülemek için, yeşil kanaldaki ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini deneysel olarak ayarlayın.
BODIPY hızla fotobleached olabilir çok parlak bir florokrom olduğu gibi görüntüleme yaparken dikkatli olun. Ayrıca, aşırı doygunluğu önlemek için pozlama süresini en aza indirin. Mobil lipid damlacıklarının bulanıklaşmasını önlemek için mavi kanala geçmeden önce tam yeşil kanal Z-yığınını yakalayın.
Hücre sınırlarını görüntülemek için, mavi kanaldaki ışık yoğunluğunu ve pozlama süresini deneysel olarak ayarlayın. Mümkünse, standart koşullarda birden fazla numunenin görüntülenmesikolaylaştırılmasını kolaylaştırmak için mikroskop kontrol yazılımında otomatik bir deneysel iş akışı ayarlayın ve kullanın. Daha da önemlisi, örnekler arasında uygun karşılaştırma sağlamak için tüm görüntüler aynı ayarlar kullanılarak elde edilmelidir.
Görüntüleme koşulları optimize edildikten sonra hücrelere odaklanın ve hem yeşil hem de mavi kanallarda görüntüleyin. Sağlam, temsili veriler elde etmek için örnek başına birden çok görüş alanı görüntüleyin. Mavi ve yeşil kanal Z-stack görüntülerini 16 bit, çok katmanlı TIFF dosyaları olarak kaydedin.
İlgili dosya adlarına yeşil veya mavi sözcükleri eklediğinden emin olun. ImageJ'de mikroskobik görüntüleri açın ve edinme sırasında hareket eden önemli sayıda hücre içeren görüntü yığınlarını kaldırın. Bunlar, bireysel Z bölümlerinde farklı konumlarda görünür.
Ardından, mavi kanalda yüksek floresan olmayan hücre parçacıkları içeren görüntü yığınlarını kaldırın. Bu genellikle görüntüleme yüzeyindeki kir veya tarım ortamındaki kirlerden kaynaklanır ve çevrelerindeki hücrelerin tespitini etkileyebilir. Ayrıca, ölü hücrelerin büyük bir oranda içeren görüntü yığınları kaldırın.
Bu görüntüler canlı hücrelere göre artan mavi floresan hücreleri görüntüler. Örnekte birkaç ölü hücrenin varlığı genellikle bir sorun olmasa da ve bu hücreler analiz sırasında otomatik olarak atılırken, bazı ölü veya ölmekte olan hücreler bazen segmentasyon algoritması tarafından canlı hücre olarak tanınabilir ve böylece bildirilen sonuçları çarpıtabilir. MATLAB'da çözümlemeye başlamak için önce bir ana klasör oluşturun ve tüm MATLAB komut dosyalarını bu konuma kopyalayın.
Ardından, çeşitli maya türlerinin adlarını içeren alt klasörler oluşturun ve ilgili TIFF görüntülerini bu konumlara kopyalayın. Şimdi, MATLAB'ı başlatın, ANA komut dosyasını açın. m ve komut dosyası çalıştırın.
Menüde, analiz edilecek maya türlerini seçin ve görüntü işlemeye başlayın. Bir elektronik tablo düzenleyicisi veya istatistiksel paket kullanarak çıktı dosyalarını gerektiği gibi inceleyin ve işleyin. İş akışı, yarı kolondan ayrılmış CSV dosyaları ve algılanan hücre nesneleri ve lipid damlacıkları ile segmente TIFF dosyaları üretir.
Burada gösterilen karmaşık EVET orta veya tanımlanan EMM orta yetiştirilen yabani tip S.pombe hücreleri vardır. EMM ortamda YES ortamda yetişen hücrelerle karşılaştırıldığında hücre hacmi birimi başına daha az lipid damlacıkları ve daha yüksek boyama yoğunluğu saptandı. Ayrıca EMM ortamda oluşan bireysel lipid damlacıkları daha büyüktü ve toplam boyama yoğunluğu arttı.
Bu emm yetiştirilen hücrelerde artan depolanmış lipid içeriği önceki bulgular ile uyum içindedir. Daha sonra, bu görüntüler EVET ortamda yetiştirilen üstel ve erken sabit kültürlerden S.japonicus hücreleri göstermektedir. Sabit faza giren hücreler hücre hacmibirimi başına lipid damlacıklarının belirgin bir şekilde azaldığını gösterirken, hacim normalleştirilmiş lipid damlacık floresans yoğunluğu iki durum arasında biraz azaldı.
Erken sabit faz lipid damlacıkları genellikle orta derecede büyük boyutta ve üssel büyüyen hücrelerden damlacıklar ile karşılaştırıldığında orta derecede daha yüksek toplam floresan yoğunluğu vardı. S.cerevisiae hücrelerinde üssel karşı sabit faza kadar yetiştirilen, sabit hücreler katlanarak büyüyen hücrelere göre birim başına biraz daha az lipid damlacıkları içeriyordu. Ancak, hacim normalleştirilmiş damlacık floresan yoğunluğu neredeyse iki katına çıktı.
Genel lipid damlacık içeriğindeki bu keskin artış, sabit fazdaki tek tek lipid damlacıklarının çok daha yüksek floresan yoğunluğu ve hacminden kaynaklandı. Bu yordamı takiben, çıktı verileri, özetlenen sonuçların çizimlerini oluşturmak ve lipid damlacık içeriğinde gözlenen herhangi bir farklılık üzerinde istatistiksel testler yapmak için R gibi istatistiksel bir paketiçinde toplanabilir. Prensip olarak, görüntü işleme boru hattı diğer mikroorganizmalardaki lipid damlacık içeriğinin analizi veya diğer nokta benzeri hücre altı yapıları analiz etmek için kullanılabilir.
