פרוטוקול זה מאפשר ניתוחים כמותיים בקנה מידה קטן עד גדול של תוכן השומנים באחסון התאים במגוון מיני שמרים והוא עושה זאת בצורה לא משוחדת ומתקנת. הטכניקה מאפשרת עיבוד מהיר של תמונות מיקרוסקופיות ומספקת יציאות כמותיות מפורטות כדי להשוות בקלות דגימות כגון מוטנטים ותאים שונים הגדלים בתנאים מגוונים. כדי להתחיל, בצע בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להכין את פתרונות הכתמים, המדיה התרבותית והתאים.
ודא כי התאים בריאים בשלב הצמיחה הרצוי לפני הפעלת הניסוי. לאחר מכן, הכינו כיסוי מיקרוסקופ כדי שכל דגימה תדמיין. מורחים מיקרוליטר אחד של פתרון ציפוי שקופיות על גבי כיסוי נקי באמצעות הצד הארוך של קצה פיפסה במיקום אופקי.
אפשר לפתרון הציפוי להתייבש לחלוטין, ולאחר מכן אחסן את הכיסויים בסביבה נטולת אבק. לאחר מכן, למדוד את הצפיפות האופטית של תרבויות התא, ועל תרבויות להיות מנותח באותו שלב הצמיחה, לנסות להגיע לערכים דומים בין כל התרבויות שנבדקו כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תרבות התא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
עבור תאי S.cerevisiae בלבד, להוסיף חמישה microliters של פתרון ציפוי שקופית לצינור גם כן. לאחר מכן, בקצרה מערבולת כל צינורות microcentrifuge, ו דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פתרון כתמי השומנים לכל עליקוט תרבות, ומערבולת אותם בקצרה.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון הדמיה של גבול התא, ומערבולת אותם לזמן קצר בפעם השנייה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 1, 000 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הסיבוב, הסר 950 מיקרוליטרים מהעל-טבעי ולהשתמש מחדש בתאים בעל-טבעי הנותר באמצעות פיפטה.
לאחר מכן, פיפטה שני מיקרוליטרים של ההשעיה התא צפוף על כיסוי מצופה לטין. לאחר מכן, מניחים את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופ נקי כדי ליצור monolayer תא, ולהמשיך מיקרוסקופיה מהר ככל האפשר כדי למזער ממצאים בהדמיה. הגדרת המיקרוסקופ דורשת חשיפות ארוכות למקורות אור חזקים העללים לגרום נזק לדגימה ולהטות תוצאות.
לכן, להגדיר את תנאי ההדמיה באמצעות שקופית מדגם ייעודי כי לא ישמש עוד יותר עבור כימות טיפת השומנים. מקם את הדגימה הייעודית על הבמה של ניגודיות פאזה או הגדרת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, והתמקד בתאים. בתוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות מחסנית Z כך שהן ישתרעו על-פני כל אמצעי האחסון של התא.
המרחק האנכי הכולל תלוי בגודל התא, ומספר הפרוסות האופטיות תלוי בצמצם המספרי של המטרה. לאחר מכן, הגדר את המוקד כך שזז יחסית למישור המוקד המרכזי. כדי לדמיין טיפות שומנים, הגדר באופן ניסיוני את עוצמת האור ותזמן החשיפה בערוץ הירוק.
להיות זהיר בעת הדמיה, כמו BODIPY הוא פלואורוכרום בהיר מאוד שעשוי להיות photobleached במהירות. בנוסף, למזער את זמן החשיפה כדי למנוע תיסה יתר. לכוד תחילה את מחסנית Z בערוץ הירוק המלא לפני המעבר לערוץ הכחול כדי למנוע טשטוש טיפות השומנים הניידות.
לתדמית גבולות תא, קבעו באופן ניסיוני את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ הכחול. במידת האפשר, הגדר ולהשתמש בזרימת עבודה ניסיונית אוטומטית בתוכנת הבקרה של המיקרוסקופ כדי להקל על הדמיה של דגימות מרובות בתנאים סטנדרטיים. חשוב לציין שיש לרכוש את כל התמונות באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה מתאימה בין דוגמאות.
לאחר אופטימיזציה של תנאי ההדמיה, התמקדו בתאים ודמיינו אותם בערוצים הירוקים והכחולים. תמונה שדות תצוגה מרובים לכל דוגמה כדי להשיג נתונים חזקים ומייצגים. שמרו את תמונות הערימה Z בערוץ הכחול והירוק כקובצי TIFF מרובי שכבות של 16 סיביות.
הקפד לכלול את המילים ירוק או כחול בשמות הקבצים המתאימים. פתח תמונות מיקרוסקופיות ב- ImageJ, והסר את כל ערימות התמונות המכילות מספר ניכר של תאים שהוזזו במהלך הרכישה. אלה מופיעים במיקומים שונים במקטעי Z בודדים.
לאחר מכן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלקיקים פלואורסצנטיים מאוד שאינם תאים בתעלה הכחולה. זה נגרם לעתים קרובות על ידי לכלוך על משטח ההדמיה או זיהומים במדיום הטיפוח ועשוי להפריע לגילוי תאים בסביבתם. כמו כן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלק גדול מהתאים המתים.
תמונות אלה יציגו תאים עם פלואורסצנטיות כחולה מוגברת בהשוואה לתאים החיים. בעוד נוכחותם של כמה תאים מתים המדגם היא בדרך כלל לא בעיה ותאים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך הניתוח, כמה תאים מתים או גוססים עשויים מדי פעם להיות מזוהים כתאים חיים על ידי אלגוריתם פילוח ובכך להטות את התוצאות שדווחו. כדי להתחיל בניתוח ב- MATLAB, צור תחילה תיקיה ראשית והעתק את כל קבצי ה- Script של MATLAB למיקום זה.
לאחר מכן, צור תיקיות משנה עם השמות של מיני השמרים השונים, והעתק את תמונות TIFF המתאימות למיקומים אלה. עכשיו, להתחיל MATLAB, לפתוח את התסריט הראשי. ותריץ את התסריט.
בתפריט, בחר את מיני השמרים שיש לנתח והתחל בעיבוד תמונה. בדוק ועיבד את קבצי הפלט כנדרש באמצעות עורך גיליון אלקטרוני או חבילה סטטיסטית. זרימת העבודה מפיקה קבצי CSV מופרדים באמצעות נקודה-פסיק וקבצי TIFF מקופלים עם אובייקטי תא שזוהו ו טיפות שומנים.
מוצגים כאן תאי S.pombe מסוג פראי שגודלו במדיום YES המורכב או במדיום EMM המוגדר. בהשוואה לתאים הגדלים במדיום YES, זוהו פחות טיפות שומנים ועוצמת כתמים גבוהה יותר ליחידת נפח תאים במדיום EMM. יתר על כן, טיפות שומנים בודדים שנוצרו במדיום EMM היו גדולים יותר והוצגו בעוצמת כתמים כוללת מוגברת.
זאת בהסכמה עם ממצאים קודמים של תוכן שומנים מאוחסן מוגבר בתאים הגדלים ב- EMM. לאחר מכן, תמונות אלה מראות תאי S.japonicus מתרבויות אקספוננציאליות ותחילת נייחות גדל במדיום כן. תאים שנכנסו לשלב נייח הראו ירידה ניכרת במספר טיפות השומנים ליחידת נפח התאים, בעוד שעוצמת פלואורסצנטיות טיפת השומנים מנורמלת בנפח ירדה מעט בין שני התנאים.
טיפות השומנים הראשונות בשלב נייח היו בדרך כלל גדולות יותר במתינות בגודלן ועוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת גבוהה למדי בהשוואה ל טיפות מתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. בתאי S.cerevisiae שגדלו לשלב אקספוננציאלי לעומת נייח, תאים נייחים הכילו מעט פחות טיפות שומנים ליחידת נפח בהשוואה לתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. עם זאת, עוצמת פלואורסצנטיות טיפה מנורמל נפח שלהם כמעט הוכפל.
עלייה חדה זו בתתוכן טיפת השומנים הכולל נבעה מעוצמת פלואורסצנטיות גבוהה בהרבה ונפח של טיפות שומנים בודדים בשלב נייח. בעקבות הליך זה, ניתן לצבור נתוני פלט בחבילה סטטיסטית כגון R כדי ליצור התוויות של תוצאות מסוכמות ולהפעיל בדיקות סטטיסטיות על כל ההבדלים שנצפו בתוכן טיפת השומנים. באופן עקרוני, צינור עיבוד התמונה יכול לשמש לניתוח של תוכן טיפת השומנים במיקרואורגניזמים אחרים או לנתח מבנים תת-תאיים אחרים דמויי נקודה.
