استخراج الكورتيزول من زعانف سمك الحفش ومصفوفات عظم الفك

طريقتنا يقدم مؤشر الإجهاد البديلة الجديدة التي يمكن أن تكون منصة لدراسات مستقبلية عديدة لقياس الكورتيزول في مؤامرة جديدة ومصفوفات الشعر. مزايا هذه التقنية هي بساطتها وقدرتها على استخدامها لتقييم مستويات التوتر حتى في الحيوانات المذبوحة. يمكن أن يساعد إنشاء علاقة بين ارتفاع مستويات الكورتيزول والحيوانات الصحية أو البشر باستخدام هذه التقنية في تشخيص بعض الأمراض.

ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة عينات بيولوجية قديمة قرون مثل هذه الحفريات القديمة لتقييم مستويات التوتر داخل فترة حياة العينة. لاستخراج الكورتيزول، تزن بها 300 زائد أو ناقص 10 ملليغرام من كل عينة على مقياس التحليلية الرقمية مع دقة 0.0001 قبل وضع العينات في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. إضافة ثلاثة ملليلتر من الايزوبروبانول إلى كل أنبوب عينة وتدوير الأنابيب في 80 دوران في الدقيقة لمدة 2.5 دقيقة لغسل الكورتيزول وإزالة أي تلوث خارجي محتمل.

بعد الغسيل الأخير، يجفف الهواء العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة سبعة أيام قبل غسل العينات ثلاث مرات أخرى كما هو موضح باستخدام المياه النقية النقية الطازجة لكل غسل. تزن بها 75 زائد أو ناقص خمسة ملليغرام من الزعنفة المجففة أو عينة عظم الفك واستخدام الخرز لطحن أخيرا العينة في 50 هيرتز لمدة 32 دقيقة. ثم، تسليم 1.5 ملليلتر من الميثانول إلى كل أنبوب من الزعنفة مسحوق أو عظم الفك ووضع العينات على دوار أنبوب في 40 دوران في الدقيقة لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد استخراج الكورتيزول، رواسب أنسجة العينة عن طريق الطرد المركزي. ونقل أعلى ملليلتر من صفراء, الكورتيزول العضوي طبقة تحتوي على من كل عينة إلى الفردية 1.5 ملليلتر أنابيب الصغرى الطرد المركزي. جفف عينات الكورتيزول عند درجة حرارة 38 درجة مئوية في غطاء أبخرة بين عشية وضحاها لتتبخر الميثانول.

في صباح اليوم التالي، إضافة 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب ودوامة والطرد المركزي العينات لجمع الكورتيزول. لتحليل ELISA، تحميل 25 ميكرولترات من كل عينة الكورتيزول القياسية المستخرجة والتحكم في مكررة في الآبار المناسبة من 96 جيدا لوحة ELISA. تحميل 25 ميكرولترات من مسيلت Assay في بئرين لتكون بمثابة الصفر وفي كل بئر غير محددة ملزمة.

مزيج 15 ميكرولترات من انزيم conjugate مع 24 ملليلتر من diluent Assay وإضافة 200 ميكرولترات من الاقتران إلى كل بئر. اخلطي اللوحة على دوار لمدة خمس دقائق بمعدل 500 دوران في الدقيقة. تليها حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، وغسل لوحة أربع مرات مع 300 ميكرولترات من 1x غسل العازلة في البئر. عكس بسرعة لوحة على بالوعة بعد كل غسل لتجاهل العازلة ونشاف لوحة على كومة من المناشف الورقية. بعد الغسيل الأخير، إضافة 200 ميكرولترات من محلول الركيزة TMB إلى كل بئر ووضع لوحة على الدوار لمدة خمس دقائق في 500 التناوب في الدقيقة الواحدة.

بعد الاختلاط، احتضان لوحة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، إضافة 50 ميكرولترات من وقف الحل لكل بئر. وخلط محتويات لوحة على الدوار لمدة ثلاث دقائق في 500 دوران في الدقيقة الواحدة أو حتى تحولت كل من الآبار من الأخضر إلى الأصفر.

ثم، قراءة الكثافة البصرية للعينات واستخدام برامج لوحة صغيرة لتحويل مستويات الكورتيزول في كل عينة إلى picograms لكل ملليغرام. وفي هذا التحليل التمثيلي، كانت مستويات الكورتيزول تميل إلى أن تكون أعلى في عينات الزعانف المغسولة بيسوبروبانول منها في تلك التي غسلتها بالماء، ولكن لم تلاحظ اختلافات كبيرة في مستويات الكورتيزول الزعانف بين أنواع سمك الحفش. لم يكن هناك تفاعل كبير بين غسل المذيبات وأنواع سمك الحفش.

فحص الكورتيزول من عظام الفك H.Huso لتحديد ما إذا كان يمكن استخدام عظام الفك الحفش كمصفوفة بديلة للزعانف كشفت أن المذيبات الغسيل لم يكن لها تأثير كبير على مستوى الكورتيزول تقاس في سمك الحفش H.Huso. وعلاوة على ذلك، كشفت البيانات عن وجود تشابه كبير بين زعانف ثلاثة أنواع من سمك الحفش تم اختبارها وفي عظام الفك H.Huso. من المهم استخدام الخرزة لطحن العينات في مسحوق ناعم واستخدام مجموعة ASI Assay التجارية المناسبة لقياس الكورتيزول الناجح.

ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للكشف عن الكورتيزول في الأسنان وغيرها من المصفوفات الصلبة والقياسات مستوى الكورتيزول توفير معلومات هامة حول كيفية تأثير البيئة على البيولوجيا الحيوانية. ويمكن استخدام هذه الطريقة كنهج جديد لتقييم مستويات الكورتيزول في أسنان حليب الأطفال في الأطفال وفي الغدد الصماء للأطفال، والبيولوجيا النفسية، والسلوكية، والدراسات الأثرية، والدراسات الجنائية.