Il nostro metodo introduce un nuovo indicatore di stress alternativo che potrebbe essere una piattaforma per numerosi studi futuri per misurare il cortisolo in nuove matrici non trame e capelli. I vantaggi di questa tecnica sono la sua semplicità e la sua capacità di essere utilizzato per valutare i livelli di stress anche negli animali macellati. Stabilire una relazione tra alti livelli di cortisolo e animali sani o umani usando questa tecnica può aiutare con la diagnosi di alcune malattie.
Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare campioni biologici secolari come questi vecchi fossili per valutare i livelli di stress all'interno della durata del campione. Per l'estrazione del cortisolo, pesare 300 più o meno 10 milligrammi di ciascun campione su una scala analitica digitale con una precisione di 0,0001 prima di posizionare i campioni in singoli tubi conici da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di isopropanolo a ciascun tubo campione e ruotare i tubi a 80 rotazioni al minuto per 2,5 minuti per lavare il cortisolo e rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione esterna.
Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente per sette giorni prima di lavare i campioni altre tre volte, come dimostrato utilizzando acqua fresca ultra pura per ogni lavaggio. Pesare 75 più o meno cinque milligrammi di pinne secche o campione di mascella e utilizzare un battitore di perline per macinare finalmente il campione a 50 hertz per 32 minuti. Quindi, consegnare 1,5 millilitri di metanolo a ciascun tubo di pinna in polvere o mascella e posizionare i campioni su un rotatore di tubi a 40 rotazioni al minuto per 18 ore a temperatura ambiente.
Dopo l'estrazione del cortisolo, sedimentare i tessuti campione per centrifugazione. E trasferire il millilitro superiore del cortisolo organico giallastro contenente lo strato da ogni campione in singoli tubi micro-centrifugati da 1,5 millilitri. Asciugare i campioni di cortisolo a 38 gradi Celsius in una cappa di fumi durante la notte per evaporare il metanolo.
La mattina seguente, aggiungere 400 microlitri di PBS a ciascun tubo e vortice e centrifugare i campioni per raccogliere il cortisolo. Per ELISA Analysis, caricare 25 microlitri di ogni campione di cortisolo standard estratto e controllare in duplicato nei pozzi appropriati di una piastra ELISA da 96 poggi. Caricare 25 microlitri di diluente assay in due pozzi per servire come zero e in ogni pozzo di legame non specifico.
Mescolare 15 microlitri di coniugato enzimatico con 24 millilitri di diluente assay e aggiungere 200 microlitri di coniugato ad ogni pozzo. Mescolare la piastra su un rotatore per cinque minuti a 500 rotazioni al minuto. Seguito da un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra quattro volte con 300 microlitri di 1x Wash Buffer per pozzo. Invertire rapidamente la piastra sul lavandino dopo ogni lavaggio per scartare il tampone e soffiare la piastra su una pila di tovaglioli di carta. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di soluzione di substrato TMB ad ogni pozzo e posizionare la piastra sul rotatore per cinque minuti a 500 rotazioni al minuto.
Dopo la miscelazione, incubare la piastra per 25 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo. E mescolare il contenuto della piastra sul rotatore per tre minuti a 500 rotazioni al minuto o fino a quando tutti i pozzi sono stati girati dal verde al giallo.
Quindi, leggere la densità ottica dei campioni e utilizzare il software a microschede per convertire i livelli di cortisolo in ogni campione in picogrammi per milligrammo. In questa analisi rappresentativa, i livelli di cortisolo tendevano ad essere più elevati nei campioni di pinne lavati con isopropanolo rispetto a quelli lavati con acqua, ma non sono state osservate differenze significative nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie di storione. Non c'è stata alcuna interazione significativa tra solventi di lavaggio e specie di storione.
L'esame del cortisolo dalle mascelle H.Huso per determinare se le mascelle di storione possano essere utilizzate come matrice alternativa alle pinne ha rivelato che il solvente di lavaggio non ha avuto effetti significativi sul livello di cortisolo misurato nello storione di H.Huso. Inoltre, i dati hanno rivelato un'elevata somiglianza tra le pinne di tre specie di storioni testate e nelle mascelle H.Huso. È importante utilizzare il battitore di perline per macinare i campioni in polvere fine e utilizzare un kit di dosaggio ELISA commerciale appropriato per una misurazione del cortisolo di successo.
Questo metodo può anche essere utilizzato per rilevare il cortisolo nei denti e in altre matrici dure poiché le misurazioni a livello di cortisolo forniscono informazioni importanti su come l'ambiente influisce sulla biologia animale. Il metodo potrebbe essere utilizzato come nuovo approccio per valutare i livelli di cortisolo nei denti da latte dei bambini umani e negli studi endocrinologici pediatrici, psicobiologici, comportamentali, archeologici e forensi.
