نشكر Kymberlee أوبراين، سيليا مور، وإدوارد Tronick (قسم علم النفس، جامعة ماساشوستس، بوسطن) لتوفير عينات شعر الإنسان تحليلها في هذه الدراسة، وستيفن سومي وأماندا Dettmer (مختبر المقارن علم السلوك، معاهد الصحة القومية) ل توفير عينات الشعر قرد هندي صغير. واستمر استخدام هذه الطريقة وقد تم دعم التطوير الأولي من قبل المعاهد الوطنية للصحة RR11122 لMAN

1. جمع العينات والتخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شعر الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين كامل طول الشعر لأخذ عينات (تصل إلى عرض قلم رصاص في القطر) مع الشريط المطاطي أو مقطع. قص الشعر أقرب إلى فروة الرأس ممكن (مع الحرص على عدم شق الجلد) مع مقص نظيفة. ملاحظة: المنطقة أخذ العينات هو معيار قمة الرأس الخلفي من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأفادت بعض المحققين انخفاضا في مستويات CORT شعر الإنسان مع البعد عن فروة الرأس 6، والذي قد يكون ناجما عن تبييض من التعرض المتكرر للماء والشامبو 7 (على الرغم من رؤية Manenschijn وآخرون. 8 وطومسون وآخرون. 9 لنتائج العكس في والذي لوحظ أي انخفاض قطعي) لتقليل تأثير هذه الإمكانات &quot;تأثير تبييض&quot;، نوصي جمع شرائح الشعر الأقرب إلى فروة الرأس بطول لا يزيد عن 3 سم (على افتراض معدل نمو من 1 سم / شهر 10، و سم 3 يحتوي على الجزء CORT التي أودعت على ما يقرب من 3 شهور). لتحقيق ذلك، استخدام مسطرة لقياس 3 سم من أول خطوة من نوعها وقطع مرة أخرى لانتاج العينة 3 سم. ملاحظة: بمجرد قص الشعر لمدة، فإنه لم يعد ضروريا للحفاظ على خيوط في المواءمة ما لم تشتمل على دراسة خفض العينة إلى شرائح 1 سم طويلة منفصلة لإنشاء تقويم بأثر رجعي من CORT ترسب على مدى فترة زمنية قبل أخذ العينات 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينة الشعر في الحقيبة مصنوعة من رقائق الألومنيوم، ورقة مغلف نظيفة، أو 15 مل المسمار غطاء البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي من النوع الذي يستخدم لغسل العينة. كما CORT غير مستقر للغاية في الشعر 2، ويمكن تخزين العينات إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية، وعند الضرورة، يتم شحنها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تمارس الإجراء جمع الشعر على المتطوعين ويجب أن يكون وزنه العينات الممارسة قبل الشروع في دراسة كاملة. ملاحظة: عينات الشعر كما SMAليرة لبنانية كما 5-10 ملغ يمكن تحليلها باستخدام الأساليب المذكورة هنا، على الرغم من أنه أمر مرغوب فيه لجمع عينات&gt; 10 ملغ لتقليل احتمال الحصول على تقييم الأثر البيئي القراءات دون أدنى CORT القياسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرد الشعر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلق شعر (100-250 ملغ) من مؤخر العنق باستخدام المقص الحيوان القياسية. يحلق أقرب إلى الجلد ممكن، والحرص على عدم شق الجلد ويتسبب في حدوث نزيف لأن مستويات CORT الدم مرتفعة للغاية بالمقارنة مع تلك التي وجدت في الشعر. ملاحظة: تم اختيار منطقة الرقبة لأخذ العينات الروتينية لأنه عموما هو مصدر جيد للشعر ويمكن ملاحظتها بسهولة لنمو الشعر قبل اختزال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينة الشعر في الحقيبة مصنوعة من رقائق الألومنيوم أو 15 مل المسمار غطاء البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي. يجب أن يتم تخزين العينات قرد الشعر وشحنها بنفس الطريقة كما هو موضح أعلاه للحصول على عينات شعر الإنسان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأن الشعر قرد، على عكس الشعر فروة الرأس الإنسان، وينمو لمدة معينة ثم شارعمكتب خدمات المشاريع المتزايدة 11، فهو عموما ليس ممكنا في هذه الحالة استخدام المسافة من الجلد كتقويم لCORT الترسيب. ومع ذلك، إذا كان الحيوان يمكن أخذ عينات أكثر من مرة (على سبيل المثال، خلال امتحانات الصحية الروتينية الدورية)، فمن المستحسن لإجراء الحلاقة الأولي لتحديد نقطة زمنية أساسية، ثم reshave نفس المنطقة بعد انقضاء الفترة الزمنية المطلوبة. أودع CORT في العينة الثانية أثناء الفاصل الزمني الحلاقة reshave، الذي يبيح للإسناد الدقيق للمحتوى CORT العينة إلى النشاط HPA أكثر من تلك الفترة 5. </li></ol></li></ol> 2. غسل العينة والتجفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل عينة الشعر الى 15 مل المسمار غطاء البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) الصف الأيزوبروبانول لكل أنبوب تليها انعكاس المتكرر لمدة 3 دقائق باستخدام المدورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الأيزوبروبانول في حاوية النفايات، مع جلا تخسر أي من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1.2 و2.1.3 مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الشعر لمدة 2-3 أيام على الأقل لضمان كاملة الأيزوبروبانول التبخر. </li></ol></li></ol> 3. طحن العينة واستخراج CORT - طريقة 1 لعينات كبيرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة طحن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ما يصل إلى 250 ملغ من الشعر المجفف إلى 10 مل الفولاذ المقاوم للصدأ طحن جرة جنبا إلى جنب مع واحد 12 ملم الفولاذ المقاوم للصدأ طحن الكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن العينة لمدة 6 دقائق بسرعة 25 هرتز باستخدام طاحونة الكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصل وزنه الى 50 ملغ من مسحوق الشعر على توازن التحليلية ومن ثم تحويلها إلى بيئة نظيفة 2.0 مل أنبوب microcentrifuge البولي بروبلين لاستخراج CORT لاحقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج CORT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.0 مل من HPLC الصف الميثانول إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على عينة المجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنبوب واحتضان العينة ل18-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع زملاءانعكاس nstant باستخدام المدورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير الشعر المجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 0.6 مل من طاف لنظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه من الشعر المجفف. </li></ol></li></ol> 4. طحن العينة واستخراج CORT - الطريقة 2 للعينات الصغيرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة طحن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ما يصل إلى 60 ملغ من الشعر في preweighed 2 مل أنبوب microcentrifuge عززت لحبة الضرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reweigh القارورة للحصول على وزن العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ثلاث حبات 3.2 مم الصلب الكروم على كل قارورة ثم تطحن العينة لا يقل عن 2 دقيقة في الخافق حبة. إذا يكشف الفحص البصري أن العينة تم المسحوق غير كافية، ثم نفذ طحن إضافية ل0.5 أو 1 دقيقة. ملاحظة: ليس هناك حاجة إلى نقل الشعر الأرض في هذه الحالة لأنه يتم تنفيذ استخراج CORT في نفس القارورة كما طحن. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج CORT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل من HPLC الصف الميثانول إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على عينة المجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنبوب واحتضان العينة ل18-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع انعكاس مستمر باستخدام المدورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الشعر المجفف. ملاحظة: تبقى حبات الكروم الصلب في الأنبوب مع الشعر خلال استخراج والطرد المركزي الخطوات، التي تمثل أقل سرعة الطرد المركزي مقارنة مع الطريقة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.0 مل من طاف لنظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه من الشعر المجفف. </li></ol></li></ol> 5. تبخر المذيبات وعينة إعادة إعماره <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف أسفل الميثانول باستخدام المبخر فراغ أو تيار من غاز النيتروجين إذا المبخر فراغ غير متوفر. إذا تم استخدام المبخر فراغ، بخار الميثانول يمكن المحاصرين عن طريقمن فخ الباردة أو فخ الكيميائية مجهزة خرطوشة الفحم المنشط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة الميثانول، إعادة استخراج CORT في حجم مناسب من EIA العازلة الفحص (فحص مخفف). إذا من المتوقع القيم CORT عالية نسبيا، ثم استخدام حجم المخزن المؤقت من 0.4 مل أو أكثر. إذا من المتوقع القيم المنخفضة نسبيا، ومن ثم يمكن خفض مستوى الصوت إلى 0.2 مل أو أقل لزيادة حساسية. ملاحظة: 0.2 مل هو حجم كاف لتشغيل مأخوذة مكررة من العينة مرتين على الأقل في حالة مطلوب باعادة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما مقايسة العينة المعاد فورا أو تجميده عند -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا. ملاحظة: إذا تم تجميد العينة المعاد، فمن المهم تجنب التسامي خلال فترة التجميد منذ تغيير في حجم العينة سيؤدي إلى قيمة CORT كاذبة عندما يتم تنفيذ العمليات الحسابية النهائية. </li></ol> 6. CORT الفحص وتحويل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة مقتطفات الشعر لCORT باستخدام ذات حساسية عالية انزيم المناعه (EIA) عدة. ملاحظة: إذا كنت تستخدم اللعابية تجارية عدة CORT EIA، اتبع توصيات الشركة المصنعة على النحو المحدد في إدراج عدة إلا أن عينات الاختبار ستكون مأخوذة مكررة من كل مستخلص الشعر المعاد بدلا من عينات اللعاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لمراقبة الجودة (QC) استخراج الشعر للاستخدام في كل فحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عدد من عينات الشعر من خارج وإما معالجتها بشكل فردي كما هو الحال في الخطوات 4.1 و 4.2 أو تجمع لهم للتجهيز عينة كبيرة كما هو الحال في الخطوات 3.1 و 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر المذيبات وإعادة تشكيل مقتطفات كما في الخطوات 5.1 و 5.2، ثم أعيد تجميع مقتطفات من عدة عينات فردية أو مجمعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة حجم مناسب للاستخراج المعاد المجمعة (على سبيل المثال 0.10 مل) في أنابيب microcentrifuge الفردية وتجميد لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد وتشغيل قسامة QC احدة من نسختين على كل صفيحة ميكروسكوبية المناعية لتوفير refeRENCE قيمة CORT للتحقق من جودة كل شوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن حساب عن طريق تحليل 10-12 QC الآبار في نفس المدى، في حين أن بين فحص السيرة الذاتية ويمكن حساب؛ معامل داخل فحص التباين (الذي يعرف بأنه الانحراف المعياري مقسوما على متوسط ​​مجموعة من القيم عينة CV) باستخدام القيم QC عبر مجموعة من أشواط. إذا كان برنامج واحد قارئ صفيحة ميكروسكوبية بحساب السيرة الذاتية لآبار استخراج مكررة يمثل كل الشعر، ثم أسلوب بديل لتحديد داخل فحص السيرة الذاتية هو لحساب متوسط ​​تلك القيم الذاتية الفردية عبر لوحة بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إن وجدت استخراج عينة تعطي قراءة أكبر من أعلى مستوى CORT في تقييم الأثر البيئي، ثم يتم تخفيف قسامة آخر من استخراج مع كمية مناسبة من العازلة الفحص ويتم تصحيح القراءة EIA اللاحقة لعامل التخفيف. كما أعادوا تحليل عينات روتينية إذا كانت السيرة الذاتية لآبار مكررة هو&gt; 10٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأنها مصممة CORT EIA مجموعات لقياس CORT فازهري في عينات السائل مثل اللعاب أو البلازما، ويجب تحويل الناتج من برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لكمية CORT لكل وحدة وزن الشعر المجفف. الصيغة التالية تحويل الإخراج مقايسة في ميكروغرام / ديسيلتر إلى خريج CORT في الشعر ملغ: (A / B) * (C / D) * E * F = 10،000 حيث A = ميكروغرام / ديسيلتر من الناتج الفحص؛ B = الوزن (في ملغ) من الشعر تعرض لاستخراج؛ C = المجلد. (في مل) من الميثانول تضاف إلى مسحوق الشعر؛ D = المجلد. (في مل) من الميثانول تعافى من استخراج والمجففة في وقت لاحق إلى أسفل؛ E = المجلد. (في مل) من العازلة الفحص المستخدمة لإعادة استخراج المجففة، وF = القيمة النهائية للشعر تركيز CORT في الغرام / ملغ. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Selye, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+the+general+adaptation+syndrome.">Stress and the general adaptation syndrome.</a> Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).</li><li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Hair+cortisol:+A+novel+biomarker+of+hypothalamic-+pituitary-adrenocortical+activity.">Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li><li>Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+neurochemistry+of+self-injurious+behavior:+A+nonhuman+primate+model.">The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model.</a> Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).</li><li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques.">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).</li><li>Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+monkey+model+of+self+injury:+Effects+of+relocation+stress+on+behavior+and+neuroendocrine+function.">A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function.</a> Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).</li><li>Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+as+a+retrospective+calendar+of+cortisol+production+-+Increased+cortisol+incorporation+into+hair+in+the+third+trimester+of+pregnancy.">Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy.</a> Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).</li><li>Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shampoo+and+water+washing+on+hair+cortisol+concentrations.">Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations.</a> Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).</li><li>Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+method+to+measure+long+term+cortisol+levels.">Evaluation of a method to measure long term cortisol levels.</a> Steroids. 76, 1032-1036 (2011).</li><li>Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+provides+a+historical+record+of+cortisol+levels+in+Cushing&#8217;s+syndrome.">Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing&#8217;s syndrome.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).</li><li>LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variations+in+growth+rate+and+sample+collection+on+interpreting+results+of+segmental+analyses+of+hair.">The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair.</a> Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).</li><li>Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+hair+growth+in+Macaca+mulatta.">Variability of hair growth in Macaca mulatta.</a> Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).</li><li>Sauv&#233;, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cortisol+in+human+hair+as+a+biomarker+of+systemic+exposure.">Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure.</a> Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).</li><li>Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+cortisol+analysis+in+hair+and+its+clinical+applications.">An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications.</a> Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).</li><li>Bechsh&#248;ft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+levels+in+hair+of+East+Greenland+polar+bears.">Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears.</a> Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).</li><li>Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Society+of+Hair+Testing+guidelines+for+drug+testing+in+hair.">Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair.</a> Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).</li><li>Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hair+follicles+display+a+functional+equivalent+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+(HPA)+axis+and+synthesize+cortisol.">Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol.</a> FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).</li><li>Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol+as+a+biological+marker+of+chronic+stress:+Current+status,+future+directions+and+unanswered+questions.">Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions.</a> Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).</li><li>Stalder, T., Kirschbaum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cortisol+in+hair+-+State+of+the+art+and+future+directions.">Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions.</a> Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).</li><li>Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol,+stress+exposure,+and+mental+health+in+humans:+A+systematic+review.">Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review.</a> Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح لتعلن.

الإجراء CORT الشعر المذكورة أعلاه بسيطة لتنفيذ، غير مكلفة نسبيا، يجعل من استخدام المواد الكيميائية متاحة بيسر والكواشف، واللوازم، والمعدات التي تتطلب، مع استثناء واحد، ومن المرجح أن يكون حاضرا في مختبر تحليلي نموذجي. الاستثناء هو جهاز طحن مثل طاحونة الكرة أو مصغرة bea...

وقد استخدم قياس CORT في البلازما واللعاب، أو أحيانا في البول أو البراز وذلك في مؤشر الإجهاد الفسيولوجية منذ اكتشاف Selye للدور المحور HPA في الإجهاد 1. على الرغم من أن العديد من ورقات وقد نشرت المتعلقة النشاط HPA إلى المواقف العصيبة الحاد، وقد أعاق هذا المجال من خلال عدم وجود مؤشر بسيط وموثوق بها من الإجهاد الفسيولوجية المزمن. تنشأ هذه المشكلة بسبب البلازما واللعاب على حد سواء تقديرات العائد &quot;نقطة&quot; من النشاط HPA التي تخضع لاختلاف الساعة البيولوجية، ويمكن أن يكون مرتبك من قبل الاضطرابات البيئية. عينات البول والبراز تسفر قياسات CORT و / أو إفراز الأيض التي تمتد عدة ساعات تصل إلى يوم كامل في بعض الحالات. جمع عينات متعددة باستخدام قد توفر أي من هذه المصفوفات مؤشر مركب الخام من مستويات CORT مع مرور الوقت، ومع ذلك، فإن أيا من هذه النهج يوفر مؤشر حقا على المدى الطويل من النشاط HPA واستجابة لهذا سيوقف لالضغوطات المزمنة. قياس CORT في الشعر بدأت لملء هذه الحاجة الهامة في الأدب الإجهاد. أظهرت الدراسات الأولية من قبل العديد من المختبرات وجود CORT في الشعر الإنسان، ولكن لم تحقق ما إذا كانت مستويات CORT الشعر تغيرت بوصفها وظيفة من التوتر 2. كما كان لدينا مختبر مهتمة لسنوات عديدة في تنظيم محور قرد هندي صغير HPA من قبل مختلف العوامل الاجتماعية والسلوكية 3، شرعنا في إنشاء والتحقق من صحة طرق لاستخراج وتحليل ريسوس قرد الشعر 4. استنادا إلى فرضية أن يتم تضمينها CORT المنقولة عن طريق الدم ببطء وبشكل مستمر في نمو الشعر، وكان الغرض من هذه الطريقة الجديدة لاستخدام مستويات المستمدة من الشعر CORT وذلك في مؤشر متكاملة من النشاط HPA على مدى فترات من أسابيع إلى أشهر. ووجهت العديد من التحديات المنهجية في تطوير هذا البروتوكول. الأولى، وكانت دراسات سابقة أظهرت أن كميات صغيرة سو تعميم CORT تفرز في العرق والزهم، وبالتالي يمكن أن معطف السطح الخارجي للرمح الشعر 2. من أجل القضاء على هذا الخلط المحتملة، وضعنا إجراء غسيل اللطيفة التي تظهر لإزالة CORT الخارجية في حين وجود تأثير ضئيل على CORT الحاضر داخل رمح الشعر النامي. وبالتالي، قرد الشعر تخضع لهذا الإجراء (أي اثنين 3 مين يغسل مع الأيزوبروبانول) خسر ما يقرب من 7-8٪ من المحتوى الكلي للCORT الشعر، ويغسل الثالثة إزالة أقل من 1٪ أكثر من الستيرويد في العينة 4. يبدو أن هناك أكثر CORT الخارجية في شعر الإنسان، منذ نفس الإجراء إزالة ما معدله 27٪ من إجمالي المحتوى CORT من العينات (ك. روزنبرغ وجيه ماير، غير منشورة). مثل الشعر قرد، ومع ذلك، تضمنت غسل إضافية أقل بكثير CORT (حوالي 7٪) من يغسل الأولين. لذلك، النتائج من كل من القرد والإنسان الشعر دعم حجته بأن معظم (إن لم يكن كلها) CORT الخارجية يمكن إزالتها مع الحفاظ على فارك الرئيسيةنشوئها CORT داخل المصفوفة الشعر الداخلية. الثانية، وأظهرت دراسات تجريبية لدينا أيضا أن طحن الشعر قبل استخلاص زيادة كبيرة الانتعاش CORT من العينة، ويفترض طريق كسر الباب مفتوحا أمام مصفوفة البروتينية المعقدة للعمود الشعر، فضلا عن زيادة المساحة المتاحة لاختراق المذيبات. تم تطوير طريقتين طحن مختلفة، ولكل منها مزاياه وعيوبه. طريقة 1، والذي يستخدم طاحونة الكرة، لديه ميزة من إنتاج أرقى مسحوق. ومع ذلك، مطحنة الكرة هو بند معدات باهظة الثمن نسبيا، وإذا ما استخدمت مع الجرار طحن القياسية والكرات، وأنها قادرة على طحن عينات اثنين فقط في كل مرة. عينات صغيرة هي أيضا من الصعب معالجة باستخدام طاحونة الكرة طحن مع الجرار القياسية. طريقة 2، والذي يستخدم beadbeater، هو أقل فعالية في القدرة الطاحنة التي. ونتيجة لذلك، متوسط ​​الانتعاش CORT هو أقل ما يقرب من 10٪ باستخدام هذا الأسلوب بالمقارنة مع مطحنة الكرة (بيانات غير منشورة). من ناحية أخرى، beadbeaterإلى حد كبير أقل تكلفة من طاحونة الكرة، 16-24 العينات يمكن أن تكون الأرض في وقت واحد اعتمادا على نموذج، وهذه الطريقة مناسبة تماما للعينات الصغيرة. بسبب الانتعاش الفرق المذكورة أعلاه، فإنه من المستحسن استخدام نفس الأسلوب طحن لجميع العينات ضمن دراسة خاصة. مرة واحدة تم تجهيزها عينات الشعر، ويتم استخراج أنها مع الميثانول وCORT في مقتطفات تم تحليلها عن طريق مجموعة EIA تجارية حساسة ومحددة صممت في الأصل لقياس CORT اللعابية. تم التحقق من سلامة إجراءات استخراج وفحص جزئيا من خلال إظهار أن التخفيفات المسلسل من مقتطفات من عينات شعر القرد أسفرت EIA القراءات التي يتوازى بشكل وثيق القراءات التي تم الحصول عليها من المعايير CORT أصيلة. نحن بعد ذلك أظهرت أن CORT الشعر (بالإضافة إلى البلازما واللعابية CORT) كان حساسا إلى الضغوطات الحياة الرئيسية لنقل تكليف إداريا من القرود إلى أرباع المساكن الجديدة 4،5. وحاضرايوفر ر رقة وصفا مفصلا للأساليب تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لمعالجة عينات شعر الإنسان والقرد، واستخراج وتحليل CORT من هذه العينات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

أدرج الكورتيزول هرمون التوتر (CORT) ببطء في جذع الشعرة متزايد من البشر، والرئيسات من غير البشر والثدييات الأخرى. قمنا بتطوير والتحقق من صحتها وسيلة لCORT استخراج وتحليل من شعر قرد هندي صغير وتكييفها في وقت لاحق هذا الأسلوب للاستخدام مع شعر فروة الرأس الإنسان. وعلى النقيض من كورت &quot;عينات نقطة&quot; تم الحصول عليها من البلازما أو اللعاب، الشعر CORT يوفر تدبيرا متكاملة من النشاط الغدة النخامية الكظرية (HPA) النظام، وبالتالي الإجهاد الفسيولوجية، خلال الفترة من هرمون التأسيس. لأن الشعر فروة الرأس الإنسان ينمو بمعدل 1 سم / الشهر، ومستويات CORT تم الحصول عليها من قطاعات عدة الشعر سم في الطول يمكن أن يحتمل أن تكون بمثابة العلامات البيولوجية من التوتر شهدت على مدى عدد من الشهور. في أسلوبنا، يتم غسلها كل عينة الشعر أولا مرتين في الأيزوبروبانول لإزالة أي CORT من الخارج من جذع الشعرة التي أودعت من عرق أو الزهم. بعد التجفيف، ووالأرض العينة إلى مسحوق ناعم لتفريق الشعر في بروتين المصفوفة وزيادة المساحة السطحية لاستخراج. يتم استخراج CORT من داخل جذع الشعرة في الميثانول، يبخر الميثانول، وأعيد استخراج العازلة في الفحص. المستخرجة CORT، جنبا إلى جنب مع معايير وضوابط الجودة، ثم يتم تحليلها عن طريق حساسة ومحددة متاحة تجاريا انزيم المناعه (EIA) عدة. يتم تحويل قراءات من تقييم الأثر البيئي لخريج CORT في ملغ مسحوق شعر الوزن. وقد استخدمت هذه الطريقة في المختبر لدينا لتحليل CORT الشعر في البشر، وعدة أنواع من القرود المكاك، القرد الأميركي، والكلاب، والدببة القطبية. وقد أثبتت العديد من الدراسات سواء من مختبرنا ومن مجموعات بحثية أخرى في تطبيق واسعة من CORT الشعر لتقييم التعرض التوتر المزمن في الطبيعية، فضلا عن بيئة معملية.

ويبين الشكل 1 النسخة المطبوعة من مجموعة تمثيلية من عينات شعر الانسان (الذكور البالغين والموضوعات البشرية النسائية) معالجتها باستخدام أسلوب 2 طحن والاستخراج. تم استخدام برامج الكمبيوتر لتوليد إخراج البيانات وتناسب منحنى السيني 4 المعلمة لمعايير CORT (الشك...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair at JoVE.com

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

الكورتيزول (CORT) يتراكم في جذع الشعرة متزايد من البشر والرئيسيات غير البشرية. وصفنا طرق لاستخراج وتحليل CORT الشعر مع دقة عالية وحساسية. قياس الشعر CORT بشكل خاص مناسبة تماما لتقييم الإجهاد المزمن على مدى فترات من أسابيع إلى أشهر.

استخراج وتحليل الكورتيزول من الإنسان والقرد الشعر

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

extraction-and-analysis-of-cortisol-from-human-and-monkey-hair

Research

JoVE Journal

Biology

28.0K Views.  University of Massachusetts, Amherst.  الكورتيزول (CORT) يتراكم في جذع الشعرة متزايد من البشر والرئيسيات غير البشرية. وصفنا طرق لاستخراج وتحليل CORT الشعر مع دقة عالية وحساسية. قياس الشعر CORT بشكل خاص مناسبة تماما لتقييم الإجهاد المزمن على مدى فترات من أسابيع إلى أشهر. 

Video: Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

استخراج السم والسم الغدة Microdissections من العناكب عن البروتين وتحليلات Transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

تقنية جديدة لتحليل الكمي لتساقط الشعر في الفئران عن طريق تحليل درجات الرمادي

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

جمع الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي من مفصل الركبة هشاشة العظام البشرية

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

استخراج وتوسيم وتنقية الخلايا الخاصة بالنسب من الجريبات الغارية البشرية

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...