هذا هو أسلوب جديد لتقييم هرمون جلوكوكورتيكويد, الكورتيزول, من الفراء كوالا. وهو يوفر علامة حيوية جديدة لتقييم الإجهاد المزمن في الكوالا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه أسلوب حساس للغاية وقابلة للتكرار مع وقت تحول سريع إلى حد ما بين إعداد العينة ومحسان الهرمونات.
هذه التقنية تسمح للتقييم الكمي للإجهاد المزمن في الكوالا، وهو أداة مفيدة للغاية لإدارة السريرية. مساعدتي في هذا الإجراء هو ديلان فوكس، وهو طالب غراد من مختبري. لبدء هذا الإجراء استرداد الفراء من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية والسماح لها ذوبان في درجة حرارة الغرفة.
ثم، وزن الفراء على توازن الدقة التحليلية المختبرية. ضع 60 ملليغرامًا من الفراء في أنبوب طرد مركزي وزنها مسبقًا وتسمّى 1.5 ملليلتر وكرر هذا حتى يتم ملء 18 أنبوبًا. باستخدام ماصة، إضافة ملليلتر واحد من 100٪ HPLC الصف isopropanol إلى كل أنبوب.
دوامة العينات لمدة 30 ثانية. سلالة كل عينة مع منخل الدقيقة الدقيقة 0.5 ملليلتر وذلك لتحقيق فصل السائل والفراء، والتخلص من السائل في حاوية النفايات. ضع كل عينة من الفراء في قارب وزنها البلاستيك المسمى.
ثم ضع قوارب الوزن في جهاز تجفيف فراغ وترك لمدة ثلاثة أيام للسماح للفراء الجافة. مرة واحدة الفراء هو جاف تماما، ووضع كل عينة في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر المسمى. ضع كل عينة في طاحونة حبة مع ثلاثة حبات فولاذية من الكروم وسحق لمدة دقيقتين في 30 يهز في الثانية الواحدة.
كرر هذا النقل مع 100٪ من الميثانول التحليلية و 100٪ من الدرجة التحليلية isopropanol حتى 18 تم ملء الأنابيب الإجمالية. بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل مليلتر واحد من تقنية الاستخراج الأولى إلى ستة أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على عينة من الفراء. اِقْف كل أنبوب، واستخدم شاكرًا لاحتضانه في درجة حرارة الغرفة مع النبض المستمر لمدة 12 ساعة على الأقل.
ثم سلالة العينات مع منخل الدقيقة الدقيقة 0.5 ملليلتر. استخدام ماصة لنقل السائل إلى أنبوب جديد يسمى 1.5 ملليلتر microcentuge، مع ضمان أن يتم التخلص من الفراء بشكل مناسب. في غطاء محرك الدخان، حاول تماما استخراج المذيبات تحت تيار من بخار النيتروجين.
ثم، إعادة تشكيل العينة المجففة مع 400 ميكرولترات من العازلة المقايسة و 100 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول الصف التحليلية. لجعل الضوابط، أولا اختيار عينات من الحيوانات مع التعرض المعروف للإجهاد. لجعل تجمع استخراج، واتخاذ 20 ميكرولترات من استخراج من كل عينة حتى يتم الحصول على حجم إجمالي 200 ميكرولترات.
تخزين تجمع استخراج في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة لتشغيل المقايسات. عندما تكون جاهزة، والحصول على عامل التخفيف لنقاط 30٪ و 70٪ ملزمة من الرسم البياني التوازي لاستخراج ضد معيار الكورتيزول، واستخدام المخزن المؤقت للمقايسة لتمييع تجمع العينة بشكل مناسب لإنشاء عناصر التحكم العالية والمنخفضة. باستخدام مجموعة الكورتيزول التجارية إعداد لوحة الشريط 96 بئر بما في ذلك العينات، والضوابط، ومعايير الكورتيزول، والآبار غير محددة ملزمة، والآبار ملزمة الحد الأقصى وفقا لتعليمات المورد.
استخدم ورقة تخطيط اللوحة المضمنة في كتيب المجموعة لقائمة مواضع العينات وعناصر التحكم والمعايير. بعد ذلك، اتبع عملية استخراج هرمون الفراء الموصوفة سابقاً للحصول على 100٪ الفراء الكوالا الميثانول المستخرج. إعداد الكواشف مجموعة الكورتيزول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ماصة 50 ميكرولترات من العينات أو المعايير في آبار اللوحة. Pipette 75 ميكرولترات من المخزن المؤقت للمقصى في الآبار غير محددة ملزمة، و 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت المقايسة في الآبار القصوى الملزمة. باستخدام ماصة مكرر إضافة 25 ميكرولترات من الكورتيزول مترافق لكل بئر.
ثم، ماصة 25 ميكرولترات من الجسم المضاد الكورتيزول في كل بئر، باستثناء الآبار غير محددة ملزمة. اضغط بلطف على جانبي اللوحة لضمان أن الكواشف مختلطة بشكل جيد. غطي اللوحة بخارج اللوحة، واستخدمي شاكر مداريًا للاهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، قم بإزالة ختم اللوحة، وابتد من لوحة البئر عن طريق غسل كل بئر بـ 300 ميكرولترات من عازلة الغسيل أربع مرات. ثم جفف الطبق عن طريق التنصت عليه على مناشف ماصة نظيفة. مايليت 100 ميكرولترات من الركيزة رباعي الميثيل بنزين إلى كل بئر.
ضع مدقّق اللوحة على لوحة البئر، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، ماصة 50 ميكرولترات من وقف حل في كل بئر. نقل لوحة في لوحة قارئ قادرة على قراءة 450 نانومتر، وحساب تركيز هرمون النهائي كما هو مبين في بروتوكول النص.
في هذه الدراسة، يتم تحديد الكشف عن مقال من الأيض هرمون الفائدة باستخدام التوازي. على منحنى التوازي، نقطة 50٪ ربط يحدد عامل تخفيف العينة على المنحنى القياسي. كما يمكن أن نرى، لم 100٪ الإيثانول و 100٪ مقتطفات isopropanol لا توفر إزاحة موازية ضد معيار الكورتيزول.
ومع ذلك، فإن استخراج الميثانول 100٪ لا توفر إزاحة موازية ضد معيار الكورتيزول. يتم تحديد معاملات الفحص الداخلي والاتّب من الاختلاف من مستخلصات عينة عالية ومنخفضة الربط يتم تشغيلها في جميع المقايسات. وينظر إلى الضوابط الداخلية المنخفضة الملزمة على أنها تجمع استخراج كوالا أنيق ، في حين أن الضوابط الداخلية عالية الملزمة ينظر إليها على أنها تجمع استخراج الكوالا المخفف واحد إلى اثنين.
ثم يتم تحديد العلاقة بين كل مستخلص المذيبات ومعيار الكورتيزول باستخدام مؤامرة الانحدار. استخراج 100٪ الميثانول يوفر أفضل خط الانحدار مع أعلى قيمة R-تربيع مقارنة مع 100٪ الإيثانول و 100٪ مقتطفات isopropanol. من المهم أن نتذكر أن خطوة غسل العينة يجب أن يتم تنفيذها قبل طحن العينات لتجنب فقدان هرمونات الستيرويد.
بعد هذا الإجراء، يمكننا قياس الهرمونات الستيرويدية الأخرى، مثل الهرمونات الإنجابية للنظر في التفاعلات بين الإجهاد والتكاثر في الكوالا. توفر هذه التقنية أداة جديدة للمجال الناشئ من علم وظائف الأعضاء الحفظ، مما يتيح التقييم غير الغازية للكورتيزول في الفراء الكوالا. توفر مجموعة الكورتيزول التجارية الكواشف بكميات دقيقة.
ومع ذلك، من المهم ارتداء معدات الحماية الشخصية لتقليل الضرر إلى حد ما في حين إجراء هذا الإجراء المختبري.
