هذا الميثوجينيك كمية كبيرة من 3D خلايا الكبد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام المواد الدقيقة وخلايا التجمع. التقدم الرئيسي لهذه التقنية هو أنه يسمح للسيطرة على حجم مجالات الكبد 3D، والحد من تشكيل مراكز نخر وفقدان النمط الظاهري. إظهار الإجراء معي سيكون يو وانغ، دكتوراه في مختبرنا.
الاستعداد لتقديم قوالب agarose عن طريق حل غرامين من درجة حرارة منخفضة ذوبان agarose في 100 ملليلتر من الماء المقطر المعقم. تسخين بعناية الخليط في الميكروويف مع اهتزاز الفاصل الزمني إلى حل agarose تماما. إضافة 520 ميكرولترات من agarose ذاب إلى 256 قالب شكل جيد والسماح لها لترسيخ.
ثم، نقل كل لوحة agarose micro إلى بئر واحد من لوحة 12-جيدا. إضافة 1.5 ملليلتر من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم إلى كل بئر والماصات صعودا وهبوطا لإزالة فقاعات. لإعداد تعليق الخلية، ابدأ بالتحجيم الوسيلة من ثقافة غير متمايزة للخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات، أو HPSCs.
شطف الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة DPBS، الكالسيوم، أو المغنيسيوم مجانا ثم إزالة العازلة. إضافة خمسة ملليلتر من كاشف تفكك الخلية إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني دقائق. مراقبة انفصال الخلايا تحت المجهر وتمديد الحضانة لمدة دقيقة أو دقيقتين إضافية إذا لزم الأمر.
وقف رد الفعل عن طريق إزالة كاشف تفكك الخلية وإضافة خمسة ملليلتر من MT الطازجة تخدم متوسطة واحدة تكملها مع 10 مثبط الصخور الدقيقة، Y27632. الماصات صعودا وهبوطا عدة مرات لتفكك الخلايا. عد الخلايا القابلة للحياة مع قياس الهيموسيتات وصبغة زرقاء trypan من أجل حساب العدد الإجمالي للخلايا اللازمة.
نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب معقمة 15 أو 50 ملليلتر الطرد المركزي والطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق لبيدة الخلايا. تخلص من السوبر وإعادة تعليق الخلايا في MT تخدم وسيطًا واحدًا مع 10 مثبطات صخور ميكرومولار لتركيز نهائي من 2.1 مليون خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك، حفظ الخلايا عن طريق إضافة 190 ميكرولترات من تعليق الخلايا المعدة لكل agarose الدقيقة جيدا واحتضان لوحات micro agarose في 37 درجة مئوية في خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.
بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من الطازجة، دافئة، تي خدمة واحدة المتوسطة مع المانع الصخور لكل بئر. إعادة لوحات إلى الحاضنة وتركها هناك لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، افحص مجال التكوين.
إعداد بولي اثنين هيدروكسي إيثيل الميثاكريلات أو الآبار المغلفة بولي هيما عن طريق حل غرامين من بولي هيما في 100 ملليلتر من 95٪ الإيثانول واثارة الحل بين عشية وضحاها على لوحة ساخنة 55 درجة مئوية. في اليوم التالي، إضافة 250 ميكرولترات من الحل إلى كل بئر من لوحة 24-جيدا وتجفيف لوحة بين عشية وضحاها في فرن 60 درجة مئوية. بدء التمايز الكبدي عن طريق إزالة بعناية MT تخدم وسيط واحد من الخلايا المصنفة سابقا واستبدالها بميليلتر واحد من التمايز endoderm جديدة المتوسطة.
بالنسبة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية، قم بتحديث المتوسط كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام. من المهم الشروع في تمايز الكبد 24 ساعة بعد البذر لتجنب التمايز التلقائي الخلية. بعد التعريفي endoderm نهائي, تبديل المتوسطة إلى وسيط تمايز الكبد لمدة خمسة أيام.
استبدال المتوسطة كل يومين، وإجراء التغيير الأخير في اليوم الأخير من مواصفات الكبد. لنقل الخلايا الكبدية إلى الآبار المغلفة بولي-هيما المعدة، قم بغسل الخلايا بتوسيط نضوج الكبد ثم إضافة ملليلتر واحد من المتوسط مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر HGF و 20 نانوغرام لكل ملليلتر OSM. Pipette الحل صعودا وهبوطا عدة مرات لرفع خلايا الكبد من لوحة agarose الصغيرة ونقلها إلى بولي هيما المغلفة جيدا.
غسل لوحة micro agarose مع ملليلتر واحد من مكملات الكبدية النضج المتوسطة ونقل المتوسطة إلى بولي هيما المغلفة جيدا. باستخدام ماصة P-100، التعرق بعناية المتوسطة الزائدة دون إزالة نصف الكبد حتى يكون هناك حوالي ملليلتر واحد من المتوسط اليسار في البئر. قم بتحديث الوسط كل 48 ساعة لمدة 12 يومًا.
إذا كان العمل مع الخلايا الجذعية الجنينية، قم بتبديل الوسيط إلى وسيط الصيانة الكبدي في اليوم 20 عن طريق إزالة وسط النضج، وغسل الخلايا بمتوسط الصيانة، ثم إضافة ملليلتر واحد من وسيط الصيانة المكمل. بعد ذلك، قم بتحديث الوسط كل 48 ساعة. يجب إجراء تغييرات فورية بعناية لتجنب الإجهاد الشديد وتشويه هذا الهيكل الكروي.
تلوين لالكبد في علامات mesenchymal يبتهج أن خلايا الكبد التي تشكلت باستخدام هذه التقنية تتكون من خلايا تشبه الكبد المحيطة نواة من الخلايا المتوسطة. توجد البروتينات الأخرى التي يتم التعبير عنها عادة في خلايا الكبد على الطبقة الخارجية من المجالات. أظهر التحليل الوظيفي للإنزيمات السيتوكروم P450 أو CYP في 30 يومًا ثقافات الغلاف الكبدي أن المجالات ثلاثية الأبعاد تعرض مستويات محترمة من نشاط CYP مقارنة بال hepatocytes الأولية البشرية.
وعلاوة على ذلك، يمكن إثبات أن خلايا الكبد تفرز بروتينات الكبد مثل الزفيرين وألفا-فيتوبروتين. أهم شيء يجب تذكره لهذا البروتوكول هو أن الماصات برفق صعودا وهبوطا الحل الذي يحتوي على 3D هيباتوسفيرس عند نقلها إلى لوحة المغلفة بولي هيما. وهذا يساعد على تجنب الإضرار بها.
مرة واحدة يتقن, هذه المنهجية يسمح جيل من مجالات الكبد 3D التي لا تزال وظيفية على مدى سنة في المختبر مع تطبيقات متعددة في النمذجة المتوفى وفحص المخدرات. واستشرافا للمستقبل، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا كمنصة لتطوير المزيد من الأنسجة الحية والميدنية ذات الهياكل المعقدة.
