Esta metogenética grande quantidade de hepatosferas 3D de células-tronco pluripotentes humanas usando os materiais finos e células de montagem. O principal avanço dessa técnica é que permite controlar o tamanho das esferas hepáticas 3D, limitando a formação de centros necroses e perda de fenótipo. Demonstrando o procedimento comigo será Yu Wang, um pós-doutorado em nosso laboratório.
Prepare-se para apresentar moldes de ágarose dissolvendo dois gramas de baixa temperatura de fusão em 100 mililitros de água esterilizada destilada. Aqueça cuidadosamente a mistura no micro-ondas com o intervalo tremendo para dissolver completamente a agarose. Adicione 520 microliters da agarose derretida a um molde de 256 bem formato e permita que ele solidifique.
Em seguida, transfira cada microplacão agarose em um único poço de uma placa de 12 poços. Adicione 1,5 mililitros de DPBS com cálcio e magnésio a cada poço e pipeta para cima e para baixo para remover bolhas. Para preparar a suspensão celular, comece aspirando o meio a partir de uma cultura indiferenciada de células-tronco pluripotentes humanas, ou HPSCs.
Enxágüe as células adicionando cinco mililitros de DPBS de temperatura ambiente, cálcio ou magnésio livre e, em seguida, remova o buffer. Adicione cinco mililitros de reagente de dissociação celular às células e incubar a 37 graus Celsius por seis a oito minutos. Observe o desprendimento celular sob um microscópio e estenda a incubação por mais um ou dois minutos, se necessário.
Pare a reação removendo o reagente de dissociação celular e adicionando cinco mililitros de MT fresco servem um meio complementado com 10 inibidores de rocha micromolar, Y27632. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para dissociar células. Conte as células viáveis com o hemótmetro e a coloração azul trypan, a fim de calcular o número total de células necessárias.
Transfira o número desejado de células para um tubo de centrífuga estéril de 15 ou 50 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos para decarar as células. Descarte o supernascer e suspenda derreta as células em MT servem um meio com 10 inibidores de rochas micromolar para uma concentração final de 2,1 milhões de células por mililitro. Em seguida, salve as células adicionando 190 microlitadores de suspensão celular preparada por micro poço de ágarose e incubando as micro placas agarose a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por duas horas.
Após a incubação, adicione um mililitro de fresco, quente, T-serve um meio com inibidor de rocha para cada poço. Devolva as placas para a incubadora e deixe-as lá por 24 horas. No dia seguinte, examine a esfera de formação.
Prepare os poços revestidos de hidroxilatil poli-dois ou poli-hema dissolvendo dois gramas de polímola em 100 mililitros de 95% de etanol e agitando a solução durante a noite em uma placa quente de 55 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 250 microliters da solução a cada poço de uma placa de 24 poços e seque a placa durante a noite em um forno de 60 graus Celsius. Inicie a diferenciação do hepatocito removendo cuidadosamente o MT para servir um meio das células anteriormente semeadas e substituindo-o por um mililitro de meio de diferenciação de endoderme fresco.
Para células-tronco embrionárias humanas, atualize o meio a cada 24 horas durante três dias. É importante iniciar a diferenciação hepatocito 24 horas após a semeadura para evitar a diferenciação celular espontânea. Após indução definitiva do endódermo, troque o meio de diferenciação de hepatoblast por cinco dias.
Substitua o meio a cada dois dias, realizando a última alteração no último dia de especificação hepatoblasto. Para transferir as hepatoferas para os poços revestidos de polímatio preparados, lave as células com meio de maturação hepatócida e, em seguida, adicione um mililitro do médio suplementado com 10 nanogramas por mililitro HGF e 20 nanogramas por MILilitro OSM. Pipetar a solução várias vezes para levantar as hepatosferas da micro placa agarose e transferi-las para um políquema revestido bem.
Lave a micro placa agarose com um mililitro do meio de maturação hepatocitada suplementada e transfira bem o meio para o políquema revestido. Usando uma pipeta P-100, aspire cuidadosamente o excesso de meio sem remover hepatosferas até que haja cerca de um mililitro de médio esquerda no poço. Atualize o meio a cada 48 horas durante 12 dias.
Se trabalhar com células-tronco embrionárias, troque o meio de manutenção de hepatócitos no dia 20, removendo o meio de maturação, lavando as células com meio de manutenção e, em seguida, adicionando um mililitro de meio de manutenção suplementada. Depois disso, refresque o meio a cada 48 horas. Mudanças imediatas devem ser realizadas cuidadosamente para evitar estresse grave e distorção desta estrutura esférica.
A coloração para hepatócito em marcadores mesenquimais revela que as hepatosferas formadas usando esta técnica são compostas de células semelhantes a hepatócitos em torno de um núcleo de células mesenquimais. Outras proteínas tipicamente expressas em hepatócitos também são encontradas na camada externa das esferas. A análise funcional das enzimas citocromáticas P450 ou CYP em culturas de hepatosfera de 30 dias mostrou que as esferas 3D apresentam níveis respeitáveis de atividade CYP em comparação com hepatócitos primários humanos.
Além disso, pode-se demonstrar que as hepatosferas secretam proteínas hepáticas como Albumina e alfa-fetoproteína. A coisa mais importante a ser lembrada para este protocolo é gentilmente pipeta para cima e para baixo a solução contendo hepatosferas 3D ao transferi-las para a placa revestida de políquema. Isso ajuda a evitar danificá-los.
Uma vez dominada, essa metodologia permite a geração de esferas hepáticas 3D que permanecem funcionais ao longo de um ano in vitro com múltiplas aplicações em modelagem de falecidos e triagem de medicamentos. Olhando para o futuro, essa tecnologia poderia ser empregada como uma plataforma para desenvolver tecidos entodérmicos e mesenquimais com arquiteturas complexas.
