يمكن أن يساهم توليد كرويات الكبد البشري باستخدام مصادر ذاتية في مجالات بحثية مختلفة مثل علم السموم والسرطان واكتشاف الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام خلايا الكبد البشرية المشتقة من BDPC لهندسة كرويات الكبد البشري ، والتحايل على النقص في خلايا الكبد البشرية الأولية أو PHH. يمكن أن تمتد الكرويات البشرية الذاتية إلى الطب التجديدي والعلاج ، خاصة في المرضى الذين يعانون من فشل الكبد الحاد.
ستوضح العملية الدكتورة آن كاثرين شوت ، قائدة المشروع في مختبري. ابدأ بإعداد 500 ملليلتر من بديل مصل KnockOut ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو وسط KSR DMSO ووسط نضج خلايا الكبد. قسمة الوسط من المخزون وأضف عامل نمو خلايا الكبد الطازجة أو HGF و oncostatin M أو OCM بتركيزات نهائية تبلغ 10 أو 20 نانوجرام لكل مليلتر لكل تغيير متوسط.
نقل ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم الخامسة أو خلايا BD-PSCs إلى صفيحة أربعة آبار مغلفة بالبيولامينين واحتضان الصفيحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام. لدعم تمايز الأديم الباطن ، قم بزراعة الخلايا لمدة خمسة أيام في وسط الأرومة الكبدية KSR DMSO وتغيير الوسط كل 48 ساعة. في اليوم الخامس ، أضف وسط نضوج خلايا الكبد واستزرع الخلايا لمدة سبعة إلى 10 أيام إضافية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، مما يضمن تغيير الوسط كل 48 ساعة.
عد الخلايا باستخدام غرفة العد ومعلق الخلية غير المتمايز BD للطرد المركزي عند 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا غير المتمايزة BD في وسط KSR DMSO عند مرتين 10 من الخلايا الست لكل تركيز ملليلتر. بعد التأكد من تعليق الخلية المفردة ، قم بإزالة أي حطام إضافي عن طريق تمرير الخلايا عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
مرة أخرى ، عد الخلايا باستخدام غرفة العد وقم بإعداد حجم كاف من كثافة بذر كل خلية لتوزيع الحجم المطلوب لكل بئر. قم بإعداد تدرج مع البذر العلوي لمليون خلية إلى كثافة بذر منخفضة تبلغ 4000 خلية. بعد ذلك ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من وسط KSR DMSO في 96 لوحة ربط منخفضة البئر وإضافة 100 ميكرولتر من تخفيف بذر الخلايا.
احتضان لوحة المرفقات المنخفضة لمدة خمسة أيام. قم بتغيير 50٪ من الوسط في اليوم الثالث أو الرابع بعد البذر عندما تكون الأجسام الكروية مضغوطة بدرجة كافية. في اليوم الخامس ، قم بتغيير الوسط إلى وسط نضج خلايا الكبد واستزرع الخلايا فيه لمدة سبعة إلى 10 أيام إضافية ، وقم بتغيير الوسط كل 48 ساعة.
بعد زراعة الخلايا لمدة 4 و 8 و 15 و 24 يوما باستخدام طريقة التمايز الموضحة سابقا ، قم بإزالة الوسائط. احتضان الخلايا مع مثبتات قبل التسخين تحتوي على 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المثبت واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما.
أضف على الفور محلول Triton X-100 بنسبة 0.1٪ وتخلل الخلايا لمدة خمس دقائق قبل غسلتين من PBS. أضف محلول مانع مصنوع من PBS و 5٪ ألبومين مصل بقري أو BSA قبل وضع الخلايا على طبق هزاز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت للتخفيف 1٪ BSA PBS وإضافة 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر.
تخلص من محلول الأجسام المضادة بعد حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وأعط ثلاث غسلات مدة كل منها خمس دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول التخفيف في كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منها ، قم بتركيب أغطية الغطاء بوسائط متصاعدة تحتوي على DAPI للتحليل المجهري.
تخلص بعناية من وسائط الاستزراع دون لمس الأجسام الكروية وأضف برنامج تلفزيوني طازج بمحلول 0.1٪ Triton X-100 واحتضانه لمدة خمس دقائق لاختراق الخلايا. اغسل الكرات الكروية مرتين بالوسط عن طريق سحب الوسط ببطء. بعد ذلك ، احتضان الأجسام الكروية مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الزائد بعناية وإعطاء ثلاث غسلات من الوسط. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية المقابلة مثل الماعز المضاد للفأر IgG Cy3 ، والماعز المضاد للفأر IgG 488 ، والأرانب المضادة للدجاج IgG Texas Red في PBS مع 1٪ BSA وإضافة 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر قبل 20 دقيقة من الحضانة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. مرة أخرى ، اغسل ثلاث مرات مع المتوسطة قبل 30 دقيقة من الحضانة في الحاضنة.
قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري قبل 10 دقائق من الاستخدام. قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التصوير. استخدم هدف التكبير 4X بالنقر فوق الزر 4X في شريط الأدوات لتحديد شريط القياس الصحيح.
ثم ضع لوحة 96 بئرا على لوحة مركز المسرح. قم بتشغيل مصدر ضوء LED ، واستخدم مرشح brightfield ، وضع اللوحة في البئر محل الاهتمام باستخدام مقبض ضبط مرحلة المحور XY. قم بالتغيير إلى مسار ضوء الكاميرا وانقر فوق الزر المباشر في برنامج التصوير لتصور الصورة على الشاشة.
تأكد من توسيط الكروي باستخدام مقابض المحور XY والتركيز باستخدام مقبض التركيز الخشن أو الدقيق. بعد ذلك ، اختر طريقة مراقبة brightfield في شريط الأدوات ، واضبط إعدادات التعرض على تلقائي ، وانقر فوق زر اللقطة في لوحة تحكم الكاميرا لالتقاط صورة. ثم احفظ الصورة كملف vsi باستخدام الاسم المناسب في مجلد الاهتمام.
ضع لوحة حماية الإضاءة المحيطة لإيقاف تشغيل ضوء LED وتغيير الفلتر لإثارة B. ثم اختر طريقة الملاحظة 488. افتح الغالق ، والتقط صورة بالنقر فوق زر اللقطة وأغلق الغالق واحفظ الملف بتنسيق vsi.
كرر العملية باستخدام مرشح لإثارة G لتكرار العملية لكل بئر من الاهتمام. أظهرت التغيرات المورفولوجية أثناء عملية التمايز الكبدي أن BD-PSCs تمايزت إلى خلايا كبدية من خلال ثلاث مراحل. تمثل المرحلة الأولى التمايز إلى خلايا الأديم الباطن.
التمايز الثاني إلى خلايا سلفية كبدية تظهر مورفولوجيا متعددة الأضلاع نموذجية. والثالث ، نضوج خلايا الكبد. أظهر تحليل التألق المناعي التعبير القوي عن علامات سلف الكبد البشري الأديم الباطن مثل بروتين ألفا الجنيني أو APF وترانسثيريتين أو TTR في الخلايا في المرحلة الأولى من عملية التمايز الكبدي في L4 إلى L8 يوم.
ومع ذلك ، انخفض تعبيرهم في L15 يوم. ظهر تعبير الألبومين أو ALB والعامل النووي لخلايا الكبد أربعة ألفا أو HNF4 ألفا أولا في L4 ، وزاد طوال وقت التمايز L4 إلى L15 ، ووصل إلى تعبير قوي ومستقر خلال وقت النضج L15 إلى L24. لوحظ التجمع التلقائي للخلايا في لوحات التعلق المنخفضة التي تحتوي على تحريض خلايا الكبد أو وسط النضج بدأ تكوين كروي.
لوحظ وجود علاقة ثابتة بين كروية الستيرويد والعدد المتغير للخلايا. كشفت الأجسام الكروية التي تشكلت وتمايزت في L14 وتعيش ملطخة بالأجسام المضادة عن النشاط الوظيفي الكبدي المحتمل للكرويات المشتقة من BD-PSCs. يعد تحضير الخلايا أحادية النواة لإعادة البرمجة أهم خطوة في هذا الإجراء.
توليد كرويات الكبد البشري هو الخطوة الأولى لإنشاء عضويات في نسخة مبسطة من الجهاز في 3D مع تشريح دقيق مشابه لتلك الموجودة في الجسم الحي. تستخدم المواد العضوية التي تم إنشاؤها في المختبر لدراسة تكوين الأعضاء وتطور الأمراض والمغذيات.
