זה מתוגנטי כמות גדולה של hepatospheres 3D של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חומרים עדין ותאי הרכבה. ההתקדמות העיקרית של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת שליטה בגודל של כדורי הכבד 3D, הגבלת היווצרות של מרכזים נמקיים ואובדן פנוטיפ. הדגמת ההליך איתי תהיה יו וונג, פוסט דוקטורט במעבדה שלנו.
היכונו להציג תבניות התעוררות על ידי המסת שני גרם של טמפרטורה נמוכה נמסה agarose ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים מעוכלים. מחממים בזהירות את התערובת במיקרוגל עם מרווח רועד כדי להמיס את ההתעוררות לחלוטין. מוסיפים 520 מיקרוליטרים של אגרוז מומס לתבנית 256 בפורמט טוב ולאפשר לו להתגבש.
לאחר מכן, להעביר כל צלחת מיקרו agarose לתוך באר אחת של צלחת 12 באר. הוסף 1.5 מיליליטר של DPBS עם סידן ומגנזיום לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות. כדי להכין את ההשעיה התא, להתחיל על ידי שאפת המדיום מתרבות מוגלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, או HPSCs.
לשטוף את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר DPBS, סידן, או מגנזיום חינם ולאחר מכן להסיר את המאגר. מוסיפים חמישה מיליליטר של ניתוב תאים לתאים ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש עד שמונה דקות. יש להתבונן בניתוק התאים תחת מיקרוסקופ ולהרחיב את הדגירה למשך שעה או שתיים נוספות במידת הצורך.
לעצור את התגובה על ידי הסרת ריאגנט דיסוציאציה התא והוספת חמישה מיליליטר של MT טרי לשרת מדיום אחד בתוספת 10 מעכבי סלע micromolar, Y27632. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לנתק תאים. לספור את התאים קיימא עם ההמוציטומטר ואת הכתמים הכחולים trypan על מנת לחשב את המספר הכולל של תאים הדרושים.
העבר את המספר הרצוי של תאים לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 או 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים. להשליך את supernatant מחדש להשעות את התאים MT לשרת מדיום אחד עם 10 מעכבי סלע micromolar עבור ריכוז סופי של 2.1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, להציל את התאים על ידי הוספת 190 microliters של השעיית תא מוכן לכל באר מיקרו אגרוז ודגירה של צלחות מיקרו אגרוז ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שעתיים.
לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של טרי, חם, T-לשרת מדיום אחד עם מעכבי סלע לכל באר. מחזירים את הצלחות לאנקובטור ומשאירים אותן שם למשך 24 שעות. למחרת, לבחון את תחום היווצרות.
הכינו בארות מצופות פולי-2 הידרוקסיאתיל או פולי-הימה על ידי המסת שני גרם של פולי-הימה ב-100 מיליליטר של 95% אתנול וערבבו את הפתרון בן לילה על צלחת חמה של 55 מעלות צלזיוס. למחרת, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של הפתרון לכל באר של צלחת 24 באר ולייבש את הצלחת לילה בתנור 60 מעלות צלזיוס. ליזום התביור hepatocyte על ידי הסרת בזהירות MT לשרת מדיום אחד מן התאים זרעים בעבר והחלפתו עם מיליליטר אחד של מדיום התברדות אנדודרם טרי.
לתאי גזע עובריים אנושיים, יש לרענן את המדיום כל 24 שעות במשך שלושה ימים. חשוב ליזום התביור hepatocyte 24 שעות לאחר הזריעה, כדי למנוע התבראות תאים ספונטנית. לאחר אינדוקציה אנדודרמה סופית, לעבור את המדיום למדיום התברואה hepatoblast במשך חמישה ימים.
החלף את המדיום כל יומיים, ביצוע השינוי האחרון ביום האחרון של מפרט hepatoblast. כדי להעביר את hepatospheres לתוך בארות מצופה פולי-hema מוכן, לשטוף את התאים עם מדיום התבגרות hepatocyte ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של המדיום בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר HGF ו 20 ננוגרם לכל OSM מיליליטר. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להרים את hepatospheres מצלחת מיקרו agarose ולהעביר אותם פולי הימה מצופה היטב.
לשטוף את צלחת מיקרו agarose עם מיליליטר אחד של מדיום התבגרות hepatocyte בתוספת ולהעביר את המדיום לפולי-hema מצופה היטב. באמצעות P-100 פיפטה, בזהירות שאף מדיום עודף מבלי להסיר hepatospheres עד שיש כמיליליטר אחד של בינוני שמאל הבאר. יש לרענן את המדיום כל 48 שעות למשך 12 יום.
אם עובדים עם תאי גזע עובריים, מעבירים את המדיום למדיום תחזוקה hepatocyte ביום 20 על ידי הסרת מדיום ההבשלה, שוטפים את התאים עם מדיום תחזוקה, ולאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תחזוקה נוסף. לאחר מכן, רענון בינוני כל 48 שעות. שינויים מיידיים חייבים להתבצע בזהירות כדי למנוע מתח ועיוות רציניים של מבנה כדורי זה.
כתמים עבור hepatocyte בסמנים mesenchymal מתענג כי hepatospheres נוצר באמצעות טכניקה זו מורכבים תאים דמויי hepatocyte המקיפים ליבה של תאים mesenchymal. חלבונים אחרים המובעים בדרך כלל בהפטוציטים נמצאים גם בשכבה החיצונית של הספירות. ניתוח תפקודי של אנזימי ציטוכרום P450 או CYP בתרבויות הפטוספירה של 30 יום הראה כי הספירות תלת-מימדיות מציגות רמות מכובדות של פעילות CYP בהשוואה להפטוציטים ראשוניים אנושיים.
יתר על כן, ניתן להדגים כי hepatospheres להפריש חלבונים בכבד כגון אלבומין אלפא-fetoprotein. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עבור פרוטוקול זה הוא בעדינות pipette למעלה ולמטה את הפתרון המכיל hepatospheres 3D בעת העברתם לתוך צלחת מצופה פולי-hema. זה עוזר להימנע מפגיעה בהם.
לאחר השליטה, מתודולוגיה זו מאפשרת את הדור של כדורי כבד 3D להישאר פונקציונלי על פני שנה במבחנה עם יישומים מרובים במודלים הונאה הקרנת סמים. במבט קדימה, טכנולוגיה זו יכולה להיות מועסקת כפלטפורמה לפתח רקמות entodermal ו mesenchymal נוספות עם ארכיטקטורות מורכבות.
