تسليم عناصر Cas9 بأمان وفعالية في الخلايا أمر بالغ الأهمية للعلاجات القائمة على تحرير الجينات. إن البروتوكولات التي نعرضها هنا تظهر نهجا جديدا في هذا الاتجاه. يستخدم البروتوكول طريقة جديدة للكهربة تسمى الكهربائي الأنبوبي.
وهذا يؤدي إلى ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة الخلوية وكذلك معدلات تحرير الجينات. طريقة الكهربائي أنبوب هو الفيروس والمخدرات ، وإثراء مراسل الحرة. ويفضل هذه في التطبيقات السريرية، وذلك مع العلاجات القائمة على تحرير الجينات.
الطريقة قابلة للتطبيق عالمياً على العديد من أنواع الخلايا. على سبيل المثال يمكن تحرير الخلايا البشرية الدم، والخلايا التائية الأولية، وغيرها من الخلايا باستخدام أسلوبنا. تستخدم طريقة الإلكترو الكهربائي أنبوب رقيقة.
إذا كنت مستخدمًا لأول مرة ، فيمكنك تجربة GFP التعبير عن الحمض النووي البلازمي. إثبات الإجراء سيكون Linyuan ما، ما بعد الدكتوراه من مختبري. لبدء هذا الإجراء الحصول على iPSCs الإنسان من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي.
ثقافة iPSCs على مصفوفة اصطناعية خارج الخلية مع خلية خالية من التغذية ثقافة المتوسطة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون اتباع تعليمات المورد. قبل ساعتين من transfection علاج iPSCs مع 10 ميكرومولار Rho المرتبطة ملف ملف يحتوي على مثبطات كيناز البروتين Y-27632. عند النقل، افصل iPSCs مع حل انفصال الخلايا إلى خلايا مفردة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم عد عدد الخلايا. لإنشاء ثقافة الخلايا الليفية أرنب الحصول على خزعة جلد الأذن من غيض من الأذن أرنب. شطف الأنسجة مرتين مع DPBS تحتوي على 5٪ من البنسلين-الستريبتومايسين.
نقل أنسجة الأذن المشطفة إلى طبق جديد لثقافة الأنسجة ستة سنتيمترات وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة، كل حوالي واحد في ملليمتر واحد. أضف بضع قطرات من FBS لمنع الأنسجة من الجفاف. بعد ذلك، انتشار الأنسجة الممزقة في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم وإضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من الطلاء استخدام التربسين-EDTA لهضم الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم عد عدد الخلايا. بعد تصميم وتوليف gRNAs وأوليغوس المانحة، وإعداد الخلايا كما هو موضح سابقا.
Resuspend 20 إلى 30، 000 خلية في 20 ميكرولترات من عازلة الكهربائي. الماصات صعودا وهبوطا بعناية لإنتاج تعليق خلية واحدة. لSnnfection Cas9 RNP، قبل مزيج اثنين من ميكروغرام من بروتين CAS9 NLS مع 0.67 ميكروغرام من GRNA في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
خلط بلطف مجمع RNP شكلت مع اثنين من ميكروغرام من ssODN مع الخلايا. باستخدام نصائح الماصات الشاملة من مجموعة الكهربة، قم بنقل خليط الخلايا إلى أنبوب كهربائي 20 ميكرولتر. ضع أنبوب الكهرباء في فتحة electroporator واضغط على الذهاب إلى النهاية.
يشار إلى دورة الإكتروليت الناجحة من خلال تقرير النبض على شاشة العرض للكهربتور. بعد نقل الكهربائي خلايا iPS الإنسان إلى ملليلتر واحد من قبل warmed Y-27632 التي تحتوي على ثقافة المتوسطة كما هو موضح سابقا. ثم لوحة الخلايا resuspended في بئر واحد من لوحة ثقافة خلية 12 جيدا.
مواصلة زراعة لوحة، والتأكد من تغيير الوسط ثقافة كل يوم. يتم إزالة Y-27632 من ثقافة iPSC الإنسان متوسطة 24 ساعة بعد electroporation. بعد 72 ساعة من الكهربة، حصد الخلايا.
بالنسبة لخلايا الخلايا الليفية الأرانب، استخدم تريبسين-EDTA لهضم الخلايا من لوحة الثقافة. ل iPSCs الإنسان استخدام حل مفرزة الخلية لهضم الخلايا من لوحات الثقافة. طرد مركزي لفترة وجيزة العينات في 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق، وإعادة تعليق الخلايا مع 350 ملليلتر من العازلة تحلل.
احتضان ليلة وضحاها في 55 درجة مئوية. في اليوم التالي استخراج الحمض النووي الجينومي مع الفينول الكلوروفورم باستخدام الإجراءات القياسية. تضخيم 100 إلى 200 زوج قواعد من شظايا الحمض النووي من المواد الهلامية باستخدام إما مجموعة استخراج هلام أو مباشرة من منتجات PCR باستخدام مجموعة PCR SV مصغرة.
لتحديد كفاءة تحرير الجينات عن طريق تسلسل مستعمرة البكتيريا، استخدم مجموعة استنساخ TOPO-TA ل ligate منتجات PCR المنقى في ناقل PCR4-TOPO. التقاط عشوائيا استنساخ البكتيريا وتسلسل إدراج باستخدام التمهيدي تسلسل عالمي المقدمة من قبل مجموعة الاستنساخ TOPO-TA. لتحديد كفاءة تحرير الجينات عن طريق التسلسل العميق، وإرسال منتجات PCR المنقى التي تم الحصول عليها سابقا لتسلسل CRISPR أمبيركون في نواة تسلسل الحمض النووي.
في هذه الدراسة يتم استخدام طريقة الإلكترو الأنبوبية بشكل فعال لتقديم CRISPR/Cas9 RNP وssODNs إلى الأرانب والخلايا البشرية ، مما يؤدي إلى تحرير الجينات القوي والدقيق. أولاً، يتم إنتاج طفرات C231Y وQ235X في جين IL2RG، ويتم إنتاج طفرة R150G في جين SPR في الخلايا الليفية الأرانب. يتم عرض تصاميم sgRNA محددة ومعدلات تحرير الجينات التي تحددها البكتيريا تا الاستنساخ هنا.
وIL2RG C231 مكان، من أصل 28 استنساخ تسلسل، واحد يحمل الطفرة C231Y دقيقة، وأربعة تحمل الطفرات الإدراج أو الحذف، و23 المتبقية هي من النوع البرية. في موضع IL2RG Q235 ، من أصل 27 استنساخ تسلسل ، واثنين تحمل طفرة Q235X دقيقة ، وثلاثة تحمل طفرة Indel ، والبقية هي من النوع البرية. في مكان SPG R150 ، من بين 20 مستنسخًا تسلسلًا ، تحمل خمسة منها طفرة جين R150 الدقيقة ، وتحمل 10 طفرات إندل ، والبقية من النوع البري.
ثم يتم استخدام الكهربائي أنبوب لتسليم Cas9 RNP وssODNs إلى iPSCs الإنسان واستهداف loci ذات الصلة سريريا في EGFR، Mybpc3، وHBB الجينات. في لوكس EGFR، 15.68٪ من الغيلات تحمل الطفرات نقطة دقيقة، 22.75٪ تحمل الطفرات إندل، و61.57٪ المتبقية هي من نوع البرية. في مركز Mybpc3 ، 37.92 ٪ تحمل الحذف الدقيق للغات TGAA الأربعة الأساسية ، و 2.24 ٪ تحمل طفرات إنديل ، و59.84 ٪ المتبقية هي نوع البرية.
في موضع HBB، 11.5٪ تحمل طفرة E6V دقيقة، 35.4٪ تحمل طفرات إندل، و65٪ المتبقية هي من النوع البرية. Cas9 RNP هو الشكل المفضل لـ Cas9 نظرًا لصغر حجمه مقارنة بالحمض النووي البلازمي. الكهربائي أنبوب هو وسيلة فعالة لتقديم Cas9 RNP.
ونحن مهتمون بشكل خاص في استخدام الكهربائي أنبوب من Cas9 RNP في الخلايا T الأولية لتطبيقات CAR T.
