ويتيح البروتوكول تقييم استجابات المضيف لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض وتركيبات اللقاحات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم العبء البكتيري والاستجابات المناعية في الجسم الحي ، باستخدام نموذج حيواني قابل للتهكم. إظهار هذا الإجراء هو (كايسي يونت) طالب دراسات عليا من مختبري
للتحصين، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم في فأرة تخدير عمرها ستة إلى اثني عشر أسبوعاً، وحمّل حقنة إنسولين ميليلتر واحدة، مجهزة بإبرة قياس 28.5 مع 0.1 ملليلتر من اللقاح الذي يهمك. عقد الحقنة في زاوية 45 درجة، مع شطبة تواجه لأعلى، وإدراج الإبرة ما يقرب من خمسة ملليمترات في deltoid من الفأر، وحقن اللقاح. إبقاء الإبرة في إدخالها في العضلات لمدة خمس إلى عشر ثوان، ثم تدوير الحقنة 180 درجة، بحيث يتم مواجهة شطبة لأسفل لإنشاء ختم، ومنع تسرب اللقاح، قبل سحب الإبرة ببطء من موقع الحقن.
ثم العودة إلى قفص الماوس ، مع الرصد ، حتى الشفاء التام. بعد حوالي أسبوعين من التعزيز، تصيب الفئران المحصنة. فهم الماوس تخدير بواسطة scruff من الصدر الظهري، وراء ريش الكتف والرقبة، ووضع الماوس تستقيم للوصول إلى الأنف.
باستخدام 200 ميكرولتر ماصة تلميح، وتطبيق ببطء 20-25 ميكرولترات من inoculum البكتيرية التي تهم كل نار من الحيوان، وعقد الماوس حتى تم استنشاق كامل inoculum. ثم تسليم حجم متساو من برنامج تلفزيوني عقيمة لمجموعة واحدة من الفئران كتحكم سلبي. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، ضع جانبًا بطنيًا مصابًا بالماوس على لوحة تشريح، واضمن الأطراف.
الرطب الجسم مع 70٪ الإيثانول، واستخدام ملقط لشبك الجلد تحت البطن في وسط الحوض. باستخدام مقص حاد، وجعل قطع عمودي يصل إلى الفك السفلي، وتشريح الجلد من الجدار البريتوني. نقل الجلد إلى جانبي الذبيحة لخلق حقل دون عائق لحصاد الأعضاء العقيمة، وفهم الصفاق سليمة تحت القفص الصدري، في أو بالقرب من الكبد.
قطع الصفاق نحو القفص الصدري لفضح الجهاز الهضمي السفلي، ونقل القولون إلى اليسار للكشف عن الطحال. باستخدام ملقط منحني، فهم الطحال، وتشريح بعيدا النسيج الضام مع مقص. ثم ضع الطحال في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على 3 ملليلتر من RPMI ، ومصل الأبقار الجنينية 5٪ على الجليد.
استخدام ملقط لتحقيق الاستقرار في القفص الصدري في عملية xyphoid، وقطع فتح الحجاب الحاجز. يجب أن تفرغ الرئتين، وتسقط نحو العمود الفقري. قطع القفص الصدري على الجانبين لإزالة الصدر، وقطع الشرايين الرئوية والأوردة لعزل وإزالة الفص المتفوق من الرئة اليمنى.
إصلاح الفص في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر من 10٪ محايد buffered formalin في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل، وعزل الفصوص المتبقية من الرئتين اليمنى واليسرى. ثم ضع الفصوص في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ، يحتوي على ملليلترين من 1٪casein في PBS على الجليد. استخدام أنبوب ملليلتر واحد مع طرف لجمع الدم ملء تجويف الصدر، ونقل الدم إلى ما قبل المسمى 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب على الجليد.
إزالة الغدد النوتية، تحت اللسان، والغدد دونماكسية والغدد الليمفاوية التي تغطي القصبة الهوائية، وفتح وإزالة الأغشية الواقية المحيطة القصبة الهوائية. باستخدام ملقط ومقص ناعم، يفصل عن المريء بعناية، وأي نسيج الضام الأخرى من أعلى الترقوة إلى أسفل الفك السفلي. استخدم ملقطًا لعقد القصبة الهوائية، وقطع القصبة الهوائية في أعلى الترقوة.
سحب أسفل القصبة الهوائية لتحقيق أقصى قدر من المرونة، وقطع القصبة الهوائية في الجزء السفلي من الفك السفلي، والحق فوق الحنجرة، وعزل حوالي سنتيمتر واحد من الأنسجة. ثم ضع الجهاز في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge يسمى مسبقًا ، يحتوي على 0.3 ملليلتر من 1٪ casein في PBS على الجليد. الآن بدوره الماوس للوصول واضحة للأنف، ورش الرأس مع 70٪ الإيثانول.
قبض يدويا على الحيوان مباشرة وراء الجمجمة، واستخدام مقص لقطع بعيدا اللحم الناعم من خطم، بدءا من أسفل الأنف والتحرك صعودا. إزالة الفراء والجلد، وشعيرات من جميع أنحاء الأنف، وإدراج نصائح من زوج منحنى من مقص في nares مع المنحنيات وأشار إلى أسفل. قطع فتح ممر الأنف نحو العينين، وخلق تشكيل V-تشبه.
ثم استخدام ملقط غرامة لجمع الحاجز الأنفي، والأنسجة الرخوة داخل تشكيل، ووضع الأنسجة في ما قبل المسمى 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب يحتوي على 0.3 ملليلتر من 1٪ الكانين في برنامج تلفزيوني، على الجليد. لمعالجة أنسجة الرئة، نقل كامل محتويات أنبوب عينة الرئة إلى 15 ملليلتر التجانس Dounce العقيمة، واستخدام آفة تجانس الأنسجة. افصل العينة حتى لا تبقى جسيمات كبيرة من الأنسجة ، وإعادة التعليق المتجانس إلى أنبوب 15 ملليلتر الأصلي.
إزالة aliquot 0.3 ملليلتر لطلاء وحدات تشكيل مستعمرة، وجمع بقية التجانس عن طريق الطرد المركزي. Aliquot 0.5 ملليلتر من السوبر في أنابيب الريف الصغرى المسماة مسبقا للتخزين في 20 درجة مئوية حتى تحليل التعبير السيتوكين من قبل إليزا. ثم، تخفيف تسلسليا 0.1 milliliter aliquots من تعليق الرئة جانبا متجانسة في 0.9 ملليلتر من PBS العقيمة لكل تخفيف، واستخدام موزع مثلث معقمة لوحة 0.1 ملليلتر من كل تخفيف مختارة تجريبيا على ما قبل المسمى 10٪ بورديت-جينغو بالإضافة إلى لوحات الستريبتوميسين.
هنا، تظهر الكثافة البصرية التمثيلية 600 القياسات والحسابات لتحقيق تعليق بكتيري واحد الكثافة البصرية، لإعداد مائة ضعف فيولوم البكتيريا المخففة ليتم تسليمها إلى الفئران. بعد سبعة أيام من تحفيز مستضد اللقاح، خلايا الطحال المحصنة من مجموعة اللقاح المركبة تنتج إنترفيرون غاما، وIL17، في حين انخفضت بشكل كبير تنظيم IL5، وتعزيز مساعد T، واحد T مساعد 17 الاستقطاب من الاستجابة المناعية خلال عدوى السعال الديكي B. مستعمرة تشكيل وحدة تعداد من البكتيريا التي تم استردادها من قضايا الجهاز التنفسي من الماوس المصاب السعال الديكي B يمكن استخدامها لتقييم الآثار الوقائية للقاح الفائدة.
العمل بأسرع وبأقصى قدر ممكن من الكفاءة من أجل تجنب نخر الأنسجة، وتخزين الأنسجة المعزولة على الجليد للحفاظ على صلاحية البكتيريا المستعادة. يمكن إجراء عملية استئصال الخلايا والحمض النووي والحمض النووي الريبي ELISpot لتقييم الخلايا المناعية، وإنتاج التحليلات، وتمكين التحليلات اللاجينية والنسخية. عند العمل مع العوامل المعدية مثل السعال الديكي البوردتيلا، من المهم أن نتذكر أن ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، والعمل في خزانة السلامة الحيوية المعتمدة من أجل منع انتقال الأمراض.
هذا البروتوكول تفاصيل تعداد CFU من الجهاز التنفسي، وتحديدا البلعوم الأنفي. لمعالجة الأسئلة في مجال اللقاح والأمراض المعدية حول استهداف الاستعمار البكتيري في الأنف.
