هذا البروتوكول المحدد جيدا يبحث في هجرة القمة العصبية الأولية في الثدييات. نستخدم هجرة القمة العصبية الأولية من أجل دراسة العيوب الخلقية التي تؤثر على القمة العصبية. هذا النهج يسمح لنا أن نلقي نظرة فاحصة على خلايا القمة العصبية لأنها تخرج من لوحة العصبية.
اختبار لالسلوكيات الخلوية في الأنسجة التي تحمل جاذبية الجينات المتحولة أو بعد العلاج الصيدلاني، يسمح بالفحص الصحي لآثار العلاج الدوائي أو التغيرات البيئية أثناء النمو الجنيني. ويمكن استخدام نهج مماثل لدراسة الخلايا العليا العصبية التي تهاجر إلى القلب أو الأمعاء أو لدراسة خلايا الورم النقيلي. التخمين تشريح حق الجنين هو التحدي.
تتغير أنسجةها بسرعة كبيرة خلال التطور المبكر. نقترح ممارسة microdissection قبل إجراء تجربة كبيرة. لأن الأجنة على قيد الحياة وثلاثية الأبعاد، والسرعة والدقة حاسمة.
في اليوم الجنيني 8.5، واستخدام أدوات وحلول معقمة لحصاد الرحم في وعاء من الجليد البارد PBS. قطع mesometrium لفصل كل جنين. تشريح الرحم بعناية، وفصل كل تورم اتّق.
حصاد الجنين في مرحلة النمو الصحيح أمر بالغ الأهمية للحد من التباين وزيادة النجاح في الالتصاق من explant إلى المصفوفة وكذلك هجرة الخلايا. تنزلق ملقط بين طبقة العضلات والأنسجة البينة للجنين واستخدام زوج ثان من ملقط لإزالة طبقة العضلات. استخدام ملقط لثقب decidua على حواف سحب mesometrial واستخدام الزوج الثاني من ملقط لتمزيق الأنسجة مفتوحة عموديا على سحب.
قشر مرة أخرى الأنسجة المبتّغة مع ملقط لتصور غشاء ricarts قبل إزالة الغشاء بعناية. سوف يصبح ساك صفار الحشوية مرئية وسيتم رصد الجنين في الداخل. إزالة ساك صفار الحشوية وأنيون، ووضع الجنين للسماح التصور من أضعاف الرأس.
قطع أضعاف الرأس فوق القلب وكشط بعيدا mesoderm الكامنة للحصول على لوحة عصبية نظيفة. وينبغي بعد ذلك تشريح حدود الصفائح العصبية. باستخدام ماصة باستور الزجاج، نقل لوحة عصبية تشريح على طبق المائية المغلفة مليئة المتوسطة كريست العصبية مكيفة ودوامة بلطف الطبق لوضع اللوحة العصبية في منتصف البئر.
ثم احتضان لوحة العصبية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للفترة الزمنية التجريبية المناسبة. في 24 ساعة بعد explanting، ضع طبق ثقافة الأنسجة في حامل العينة من مجهر التباين الوجه، والشريط أسفل غطاء لوحة وإبرة ثاني أكسيد الكربون لمنع اهتزاز خلال اقتناء متعددة جيدا. ثم التركيز على الخلايا العصبية القحفية في التكبير 10 مرات مع حلقة مرحلة مطابقة في المكثف المحدد.
لتحديد قدرة الخلية العصبية المهاجرة، تعيين المجهر للحصول على إطار واحد كل خمس دقائق في التكبير 10 مرات. لقياس مورفولوجيا الخلية، تعيين المجهر للحصول على إطار واحد في الدقيقة الواحدة في تكبير 40 مرة. لقياس ديناميات lamellipodia، تعيين المجهر للحصول على إطار واحد كل 10 ثانية لمدة 10 دقائق في التكبير 40 مرة.
للتصوير متعدد الآبار، تعيين المرحلة الميكانيكية للتنقل بين مواقع X، Y المختارة من الفائدة، وتأكد من أن خلايا قمة الجمجمة العصبية هي في التركيز وأن مواقف المرحلة صحيحة. ثم انقر فوق الحصول على لبدء التصوير الفاصل الزمني. لتعقب خلية واحدة، افتح J الصورة واستيراد البيانات كملفات مكدس tiff.
تغيير الاتجاه والسطوع ومستويات التباين وانقر فوق تحليل وتعيين مقياس لمعايرة الملفات نقطة stk في ميكرومتر بكسل وفقا لإعدادات المجهر. انقر فوق المكونات الإضافية والتتبع والتتبع اليدوي لفتح الصورة J دليل خلية تتبع البرنامج المساعد وحدد إضافة المسار لبدء تتبع الخلية. ثم تتبع الخلايا من خلال جميع إطارات الأفلام الفاصل الزمني باستخدام النواة كنقطة مرجعية.
لتقييم القدرة على الهجرة في القمة العصبية، افتح برنامج تحليل الترحيل المناسب وانقر فوق علامة تبويب بيانات الاستيراد لاستيراد بيانات تتبع الخلايا كملف txt نقطة. ضمن مجموعات البيانات والتهيئة، حدد عدد الشرائح أو الإطارات التي سيتم تحليلها وقم بتعيين معايرة X Y والفاصل الزمني بين الإطارات. حدد تطبيق الإعدادات لحفظ الإعدادات.
ثم حدد رمز بيانات المؤامرة لتشكيل مسارات المسار وحدد رمز الإحصاء لتحديد المسافة ومقاييس السرعة. لتحديد منطقة الخلية العليا العصبية والتمور ، وفتح صورة J وتحت تحليل وتعيين القياسات ، انقر لتحديد المعلمات شكل الخلية ، منطقة الخلية ، ومحيط و واصف الشكل. استخدام أداة اختيار اليد الحرة لرسم يدويا مخطط حول كل خلية باستخدام حدود غشاء الخلية كدليل.
اضغط على مفاتيح التحكم + B على لوحة المفاتيح للحفاظ على تراكب حدود الخلية على الصورة وكرر لكل خلية خلال كل إطار الفاصل الزمني. انقر فوق تراكب الصورة والوصول إلى مدير الفائدة وحدد الخلايا ذات الاهتمام. ثم انقر فوق قياس للحصول على قيم لمعلمات شكل الخلية المحددة من الفائدة.
في غضون 24 ساعة من explant والثقافة ، يمكن ملاحظة منطقة من قمة العصبية القحفية الظهارية قبل الهجرة بوضوح إلى محيط explant اللوحة العصبية. وعلاوة على ذلك، فإن مجموعة فرعية من الخلايا العليا العصبية قد خضعت لظهارية للانتقال الظهارية وتظهر mesenchymal تماما. ثقافات Explant مطلية إما على هيدروجيل خارج الخلية على أساس مصفوفة أو fibronectin، تشكل هياكل explant مماثلة تتألف من قمة اللوحة العصبية العصبية قبل التاريخ العصبي وفئات الخلايا العصبية المهاجرة.
ومع ذلك explants مطلية على fibronectin إنتاج الخلايا مع lamellipodia أكثر بروزا في حافة الخلية الرائدة على ما يبدو أكثر استقطابا في اتجاه الهجرة. الوقت المجهر الفاصل يسمح لتتبع X، إحداثيات Y من الخلايا الفردية وتحليل هجرة الخلايا قمة العصبية وتحليل ديناميات مورفولوجيا الخلايا العصبية القحفية على مر الزمن. من خلال تحديد أغشية الخلايا الفردية ، يمكن حساب منطقة الخلية وقياسات محيط من جميع إطارات الأفلام للسماح بالتجميع الكمي اللاحق لمنطقة الخلية ودائرية الأفراد ومجموعات الخلايا.
لاحظ أنه عندما تنتقل الخلايا بعيداً عن explant، فإن منطقة الخلية تزداد بشكل ملحوظ بينما تظل الخلايا الدائرية ثابتة نسبيًا، مما يشير إلى أنه أثناء خروج الخلايا من الحافة الظهارية وفقدان الخلية إلى جهات الاتصال الخلوية، فإنها تظهر مساحة انتشار الخلايا المتزايدة. إيلاء اهتمام خاص لكشط بعيدا mesoderm الكامنة للحصول على لوحة عصبية نظيفة، وهذا يعزز هجرة الخلايا قمة العصبية بعيدا عن الأنسجة. يمكن إجراء العديد من التقنيات الأخرى مثل الكبت المناعي، أو تحليل RTPCR، أو الخلية المفردة لتحليل البروتينات المختلفة أو الجينات ذات الاهتمام بين مجموعات مختلفة من الخلايا الثقافية.
نحن مهتمون في لفات النمو من بعض جينات الورم الأرومي العصبي الرئيسية التي قد تشارك في هجرة الخلايا ذروتها العصبية وفي استخدام هذا النهج لدراسة جينات الأمراض البشرية.
