小鼠原发性颅神经冠细胞的解剖、培养与分析，用于神经冠细胞脱角和迁移研究

这种定义明确的协议着眼于哺乳动物的主要神经峰迁移。我们使用初级神经峰迁移来研究影响神经峰的先天缺陷。这种方法使我们能够更仔细地研究神经峰细胞，因为它们从神经板块中出现。

在携带突变基因诱惑的组织或药物治疗后对细胞行为进行测试，允许对药物治疗或胚胎发育过程中环境变化的影响进行健康检查。类似的方法可用于研究迁移到心脏或肠道的神经峰细胞或研究转移性肿瘤细胞。猜测胚胎权利的解剖是具有挑战性的。

其组织在早期发育过程中变化非常快。我们建议在进行大实验之前练习微切除。因为胚胎是活的，三维的，速度和精度是至关重要的。

在胚胎第8.5天，使用无菌工具和溶液将子宫收获成冰冷PBS容器。切开胚胎分离。仔细解剖子宫，分离每个十分肿胀。

在正确的发育阶段收获胚胎对于减少变异性以及增加外植体附着力和细胞迁移的成功至关重要。在肌肉层和胚胎的十分组织之间滑动钳子，并使用第二对钳子去除肌肉层。使用钳子刺穿 mesome 工业拉的边缘的十二分，并使用第二对钳子将垂直于拉扯的组织撕裂。

用钳子剥回十分组织，在小心去除膜之前，将膜可视化。内脏蛋黄将变得可见，胚胎将被观察里面。取出内脏蛋黄和黄牛，并放置胚胎，使头部折叠可视化。

切开心脏上方的头部褶皱，刮掉底层的中皮，以获得干净的神经板。然后应解剖神经板边界。使用玻璃巴斯德移液器，将解剖的神经板转移到充满调节神经波峰介质的水凝胶涂层盘中，然后轻轻地旋转盘，将神经板放在井的中间位置。

然后在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育神经板，以适当的实验时间。在开植后24小时，将组织培养皿放入面部对比显微镜的标本架中，并胶带取下板盖和二氧化碳针，以防止在多井采集过程中发生震动。然后专注于颅神经波峰细胞在10倍的放大率与匹配的相环在选定的冷凝器。

要量化神经波峰细胞迁移能力，请将显微镜设置为每五分钟以 10 倍的放大倍率获取一帧。要量化细胞形态，请将显微镜设置为每分钟以 40 倍的放大倍获得一帧。要量化拉梅利波迪亚动力学，请将显微镜设置为每 10 秒获取一帧，10 分钟，放大倍数为 40 倍。

对于多孔成像，设置机械阶段，在选定的 X、Y 感兴趣位置之间移动，并确认颅神经波峰细胞处于焦点位置，并且舞台位置正确。然后单击"获取"以开始时间推移成像。对于单单元格跟踪，打开图像 J 并将数据导入为 tiff 堆栈文件。

更改方向、亮度和对比度级别，然后单击分析和设置比例，根据显微镜设置以像素微米校准点 stk 文件。单击插件、跟踪和手动跟踪以打开图像 J 手动单元格跟踪插件，并选择添加跟踪以开始单元格跟踪。然后，使用原子核作为参考点，跟踪所有延时电影帧的细胞。

要评估神经峰迁移能力，请打开一个合适的迁移分析软件程序，然后单击导入数据选项卡以将细胞跟踪数据导入为点 txt 文件。在数据集和初始化下，选择要分析的切片或帧数，并设置 X Y 校准和帧之间的时间间隔。选择"应用设置"以保存设置。

然后选择绘图数据符号以形成轨迹图，然后选择统计符号以量化距离和速度度量。要量化神经波峰细胞面积和圆形，请打开图像 J 并在分析和设置测量值下，单击以选择细胞形状参数、细胞面积、周长和形状描述符。使用自由手工选择工具，使用细胞膜边界作为参考，手动绘制每个单元格周围的轮廓。

按键盘上的 Control+B 键，以保持图像上的单元格轮廓叠加，并在每个时间间隔帧上重复每个单元格。单击图像叠加并到达兴趣管理器并选择感兴趣的单元格。然后单击度量值以获取所选单元格形状参数的值。

在24小时内的外植和培养，一个区域的迁移性上皮神经波峰可以清楚地观察到周围的神经板外植。此外，神经波峰细胞的亚细胞将经历上皮到中分质过渡，并出现完全的分体。在基于细胞外基质基水凝胶或纤维素的镀膜培养物上，形成由神经板预体神经波峰和迁移神经峰细胞群组成的相似的外植结构。

然而，镀在纤维素上的外植产生细胞，细胞前沿的拉梅利波迪亚更突出，在迁移方向上似乎更加两极分化。时间推移显微镜允许跟踪单个细胞的X，Y坐标，分析神经波峰细胞迁移，并分析颅神经波峰细胞形态动力学随着时间的推移。通过概述单个细胞膜，可以从电影的所有帧计算细胞面积和周长测量，以便随后量化细胞面积和单个细胞和细胞群的循环。

请注意，当细胞从外植迁移时，细胞面积显著增加，而细胞循环度保持相对恒定，这表明当细胞偏离上皮边缘并失去细胞接触细胞时，它们显示细胞分布面积增加。特别注意刮掉底层的中皮，以获得干净的神经板，因为这有助于神经峰细胞从组织外迁移。许多其他技术，如免疫污染，RTPCR，或单细胞分析可以执行，以分析不同的蛋白质或感兴趣的基因在不同的培养细胞群体。

我们对一些关键神经母细胞瘤基因的发育卷感兴趣，这些基因可能参与神经波峰细胞迁移，并有兴趣使用这种方法研究人类疾病基因。