Questo protocollo ben definito esamina la migrazione primaria della cresta neurale nei mammiferi. Usiamo la migrazione primaria della cresta neurale per studiare i difetti alla nascita che influenzano la cresta neurale. Questo approccio ci permette di dare un'occhiata più da vicino alle cellule della cresta neurale man mano che emergono dalla piastra neurale.
Il test per i comportamenti cellulari nei tessuti che trasportano allure di geni mutanti o dopo il trattamento farmaceutico, consente lo screening sanitario per gli effetti del trattamento farmacologico o i cambiamenti ambientali durante lo sviluppo embrionale. Un approccio simile può essere usato per studiare le cellule della cresta neurale che migrano verso il cuore o l'intestino o per studiare le cellule tumorali metastatiche. Indovinare l'anatomia dell'embrione giusto è una sfida.
I suoi tessuti cambiano molto rapidamente durante lo sviluppo precoce. Suggeriamo di praticare la microdisezione prima di intraprendere un grande esperimento. Poiché gli embrioni sono vivi e tridimensionali, la velocità e la precisione sono cruciali.
Al giorno embrionale 8.5, utilizzare strumenti e soluzioni sterili per raccogliere l'utero in un contenitore di PBS ghiacciato. Tagliare il mesometrio per separare ogni embrione. Sezionare attentamente l'utero, separando ogni gonfiore deciduo.
La raccolta dell'embrione nella giusta fase di sviluppo è fondamentale per ridurre la variabilità e aumentare il successo nell'adesione dell'espianto alla matrice e alla migrazione cellulare. Far scorrere le forcep tra lo strato muscolare e il tessuto deciduo dell'embrione e utilizzare un secondo paio di forcelle per rimuovere lo strato muscolare. Utilizzare le forcep per perforare la decidua ai bordi dell'attrazione mesometrica e utilizzare la seconda coppia di forcep per strappare il tessuto aperto perpendicolarmente all'attrazione.
Sbucciare il tessuto deciduo con le forcep per visualizzare la membrana dei ricarti prima di rimuovere attentamente la membrana. Il becco viscerale del tuorlo diventerà visibile e l'embrione sarà osservato all'interno. Rimuovere il becco viscerale del tuorlo e l'anione e posizionare l'embrione per consentire la visualizzazione della piega della testa.
Tagliare la piega della testa sopra il cuore e raschiare via il mesoderma sottostante per ottenere una piastra neurale pulita. I bordi delle piastre neurali dovrebbero quindi essere sezionati. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, trasferire la piastra neurale sezionata su un piatto rivestito di idrogel riempito con mezzo di cresta neurale condizionato e ruotare delicatamente il piatto per posizionare la piastra neurale al centro del pozzo.
Quindi incubare la piastra neurale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per il periodo di tempo sperimentale appropriato. A 24 ore dopo l'espianto, posizionare il piatto di coltura tissutale nel supporto del campione di un microscopio a contrasto facciale e rastremare il coperchio della piastra e l'ago di anidride carbonica per evitare scosse durante l'acquisizione multi-pozzo. Quindi concentrati sulle cellule cranici della cresta neurale con un ingrandimento 10 volte superiore con un anello di fase corrispondente nel condensatore selezionato.
Per quantificare la capacità migratoria delle cellule della cresta neurale, impostare il microscopio in modo che acquisisca un fotogramma ogni cinque minuti con un ingrandimento 10 volte superiore. Per quantificare la morfologia cellulare, impostare il microscopio in modo che acquisisca un fotogramma al minuto con un ingrandimento 40 volte superiore. Per quantificare la dinamica lamellipodia, impostare il microscopio in modo da acquisire un telaio ogni 10 secondi per 10 minuti con un ingrandimento 40 volte superiore.
Per l'imaging multi-pozzo, impostare lo stadio meccanico per spostarsi tra le posizioni di interesse X, Y selezionate e confermare che le cellule della cresta neurale cranici sono a fuoco e che le posizioni dello stadio sono corrette. Quindi fare clic su acquisisci per avviare l'imaging time lapse. Per il rilevamento di singole celle, apri l'immagine J e importa i dati come file dello stack tiff.
Modificare i livelli di orientamento, luminosità e contrasto e fare clic su analizza e impostare la scala per calibrare i file stk punti in pixel micrometri in base alle impostazioni del microscopio. Fare clic su plug-in, tracciamento e tracciamento manuale per aprire il plug-in di tracciamento manuale delle celle J dell'immagine e selezionare aggiungi traccia per iniziare il tracciamento delle celle. Quindi tenere traccia delle celle attraverso tutti i fotogrammi dei filmati time-lapse utilizzando il nucleo come punto di riferimento.
Per valutare la capacità migratoria della cresta neurale, aprire un programma software di analisi della migrazione adatto e fare clic sulla scheda importa dati per importare i dati di rilevamento delle celle come file dot txt. In Set di dati e inizializzazione selezionare il numero di sezioni o fotogrammi da analizzare e impostare la calibrazione X Y e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi. Selezionare Applica impostazioni per salvare le impostazioni.
Quindi selezionate il simbolo dei dati del plottaggio per formare i tracciati di traiettoria e selezionate il simbolo della statistica per quantificare le misure di distanza e velocità. Per quantificare l'area e la circolarità delle cellule della cresta neurale, aprire l'immagine J e sotto analizzare e impostare le misurazioni, fare clic per selezionare i parametri della forma cellulare, l'area cellulare, il perimetro e il descrittore di forma. Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare manualmente un contorno intorno a ogni cella utilizzando i limiti della membrana cellulare come guida.
Premere CTRL+B sulla tastiera per mantenere la sovrapposizione del contorno della cella sull'immagine e ripetere per ogni cella ogni fotogramma di lasso di tempo. Fare clic su sovrapposizione immagine e per raggiungere il gestore interessi e selezionare le celle di interesse. Quindi fare clic su misura per ottenere i valori per i parametri di interesse della forma cella selezionati.
Entro 24 ore dall'espianto e dalla coltura, una regione della cresta neurale cranica epiteliale pre-migratoria può essere chiaramente osservata per circondare l'espianto della piastra neurale. Inoltre, una sottopopolazione di cellule della cresta neurale avrà subito una transizione epiteliale a mesenchimale e apparirà completamente mesenchimale. Le colture di espianto placcate su un idrogel o fibronectina a matrice extracellulare formano strutture di espianto simili composte da cresta neurale premintoria a piastre neurali e popolazioni di cellule della cresta neurale migratoria.
Tuttavia gli espianto placcati sulla fibronectina producono cellule con lamellipodia più prominenti sul bordo anteriore della cellula apparentemente più polarizzate nella direzione della migrazione. La microscopia time lapse consente il tracciamento delle coordinate X, Y delle singole cellule e l'analisi della migrazione delle cellule della cresta neurale e l'analisi della dinamica della morfologia delle cellule della cresta neurale craniche nel tempo. Delineando le singole membrane cellulari, le misurazioni dell'area cellulare e del perimetro possono essere calcolate da tutti i fotogrammi dei film per consentire la successiva quantificazione dell'area cellulare e la circolarità di singoli e gruppi di cellule.
Si noti che quando le cellule migrano lontano dall'espianto, l'area cellulare aumenta significativamente mentre la circolarità delle cellule rimane relativamente costante, suggerendo che quando le cellule si allontanano dal bordo epiteliale e perdono da cellula a contatto cellulare, mostrano un aumento dell'area di diffusione cellulare. Prestare particolare attenzione alla raschiatura del mesoderma sottostante per ottenere una piastra neurale pulita, in quanto ciò promuove la migrazione delle cellule della cresta neurale lontano dal tessuto. Molte altre tecniche come l'immunostaining, l'RTPCR o l'analisi a singola cellula possono essere eseguite per analizzare diverse proteine o geni di interesse tra diverse popolazioni di cellule di coltura.
Siamo interessati ai rotoli di sviluppo di alcuni geni chiave del neuroblastoma che potrebbero essere coinvolti nella migrazione delle cellule della cresta neurale e all'uso di questo approccio per studiare i geni delle malattie umane.
