الكيانات التي تُلزم SUMO تجعل من الممكن عزل البروتينات سومولاتيد الذاتية في الجسم الحي. هذا هو بدلا من التحدي بسبب وجود البروتياز سومو محددة نشطة والكسور المنخفضة من البروتينات سومولات في الجسم الحي. إن عزل البروتيوم سوموليت باستخدام الكيانات المُلزمة لـ SUMO مفيد لأنه يؤجل زيادة في التقارب العام لركائز سومو.
ويرجع ذلك إلى حقيقة أن SUBEs شائعة في البروتينات التي تتألف من تكرارات مترادفة من SIMs وبالتالي الاعتراف جزيئات سومو على البروتينات المعدلة على وجه التحديد. استخدام الكيانات سومو ملزمة لعزل وتوصيف البروتيوم سوموليتيد في سرطان الكبد هو وسيلة سريعة وحساسة. وهو يوفر معلومات سابقة عن الدور غير المعروف لمسار سومويليشن في سرطان الكبد في نهج علاجي محتمل.
يمكن استخدام الكيانات التي تُربط سومو لعزل البروتيوم سوموليتيد وتوصيفه في الأنسجة الأخرى إلى جانب الكبد، سواء من العينات البشرية أو النماذج الحيوانية، وكذلك في العديد من النماذج الخلوية. على الرغم من أن هذه التقنية من السهل تنفيذها، يجب توخي الحذر عند تحليل عدة عينات في نفس النوع. مكعب برودة إلى عدة خطوات المعنية.
لذلك، نوصي بالتسوية الدقيقة من الأنابيب قبل بدء هذه التجربة. إن العرض المرئي لاستخدام الكيانات الملزمة لـ SUMO يسهل ثورة هذا البروتوكول خاصة بسبب صعوبات التعامل مع البتات وفقدان المواد أثناء البروتوكول. وقد سبق أن تم إعداد خلايا الكبد البشرية من قبل خلايا الطلاء في لوحات P100 بكثافة من 1.2 إلى 1.5 مليون خلية في الطبق الواحد والحفاظ عليها في وسائل الإعلام القياسية للنمو عند 37 درجة مئوية.
عندما تكون على استعداد لاستخدام الخلايا، وpireate وسائل الإعلام من لوحات وغسلها مع خمسة ملليمترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. ضع اللوحة على الجليد وأضف 500 ميكرولترات من عازلة التحلل تكملها وفقا لاتجاهات المخطوطة. ثم استخدم مكشطة الخلية لكشط بلطف الخلايا قبالة الجزء السفلي من لوحة في المتوسطة تحلل.
بدلا من ذلك، حصاد الخلايا عن طريق التربسينيونية وإضافة ملليلتر واحد من التربسين-EDTA إلى لوحة التأكد من أن الخلايا مغطاة. وضع لوحة في حاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للسماح لهم بالانفصال عن لوحة، ثم إضافة ملليلتر من متوسط النمو قبل الدافئة لوقف التربسينية. الطرد المركزي الخلايا في 150 مرات G لمدة 10 دقائق وpirmate فائقة.
ثم غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي لمدة 10 دقائق أخرى. التعرق وأضيف 500 ميكرولترات من عازلة التحلل. الطرد المركزي الخلايا الليفية في 15000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، ثم نقل supernatants إلى أنبوب جديد والتخلص من بيليه.
عندما تكون جاهزة لاستخدام كبد الماوس المقطوع، التجانس 75 ملليغرام من شظايا المجمدة الطازجة أو قطعت في ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة. تشغيل المهيج وفقا لاتجاهات المخطوطة. بعد تجانس الأنسجة، الطرد المركزي العينات في 15000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
نقل المابير إلى أنبوب جديد والتخلص من بيليه. إعداد الخرز الجلوتاثيون عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المياه دي المتأينة إلى 70 ملليغرام من الخرز وإعادة تشكيلها بين عشية وضحاها في أربعة degresss مئوية. بعد التورم ، اغسل الخرز ثلاث مرات بـ 10 ملليلتر من الماء المئين أو PBS ، والطرد المركزي بمعدل 300 مرة G لمدة خمس دقائق بعد كل غسل.
بعد يغسل، resuspend الخرز في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني للحصول على 50٪ الطين لكل عينة في 100 ميكروغرام من GST-SUBEs أو GST السيطرة على 100 ميكرولترات من الجلوتاثيون حبة الطين و500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. احتضان الخليط في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل أثناء الدوران، ثم استعادة الخرز عن طريق الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني. خذ 10٪ من الخلية المعدة مسبقًا وتمييعها في حجم متساوٍ من 3X غليان المخزن المؤقت.
إضافة 450 ميكرولترات من lysate أوضح إلى 100 ميكرولترات من الخرز الجلوتاثيون الطين. احتضان lysate مع الخرز في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل في حين تناوب ببطء. بعد الحضانة، تدور أسفل الخرز في 300 مرة G لمدة خمس دقائق وجمع سوبرنانت للتحليل.
نقل 10٪ من حجم إجمالي إلى أنبوب منفصل وإضافة وحدة تخزين متساوية من 3X عازلة الغليان. غسل العينة المتبقية ثلاث مرات عن طريق إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS مع 05٪ توين 20 والغزل عليه في 300 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. الطامح بعناية مُتطّع التأكّد من عدم وجود سائل.
ثم elute العينة مع 15 ميكروليترس من 3X العازلة الغليان و 15 ميكرولترات من العازلة تحلل. تشغيل تحليل لطخة غربية وفقا لاتجاهات المخطوطة. إذا كان أداء قياس الطيف الشامل، desalt الببتيدات باستخدام المرحلة تلميح C18 microcolumns وإعادة إضافتها في 0.1٪ حمض فشكل قبل التحليل.
قم بتحميل العينات على نظام LC-MS وتحليلها في ثلاث ية. المضي قدما في تحديد البروتين وحساب وفرة باستخدام البرامج المرتبطة بها. إجراء تحليل إحصائي وفقا لتوجيهات المخطوطة.
وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل البروتينات SUMOylated في الفئران مع نقص الجليسين ن ميثيلtransferase الذي يسبب التنمية التلقائية لسرطان الكبد وsomates نوع البرية. تم تنفيذ تلطيخ Ponceau S على الإدخال، تدفق من خلال، والكسور من قبل من الغواصات سحب أسفل المقايسة. تحليل لطخة الغربية من LKB1 القبض مع SUBEs يبين أن مستويات SUMOylation LKB1 يتم زيادة في أورام الكبد.
واستخدمت خلايا الكبد البشرية والخلايا الظهارية الكبد غير المحولة للتحقيق في قدرة مصيدة SUMO على التفاعل مع البروتينات سومويلاتية بشكل طبيعي. أولاً، تم استخدام تلطيخ البروتين التقليدي لتصور إجمالي المواد التي تم التقاطها باستخدام SUBEs. ثم أظهرت القياس الطيفي الشامل أن 742 بروتينًا تم إثراؤها في عينة الخلايا كبدية SUBEs و577 تم إثراؤها في عينة الخلايا الظهارية غير المحولة في الكبد.
عند إجراء التجارب مع SUBEs، من المهم الحفاظ على الخلايا والأنسجة على الجليد وإضافة ملليلتر محددة إلى العازلة تحلل من أجل الحفاظ على نقاء سومولاتد. بعد التصور من البروتيوم سوموليليد مع SUBEs، يمكننا العثور على توصيف باستخدام إما تحليل لطخة الغربية أو قياس الطيف الشامل. تطبيق SUBEs لعزل وتوصيف البروتيوم سومويلات في أنسجة سرطان الكبد وخلايا الكبد يمهد الطريق لاستكشاف دور التعديلات بعد الترجمة من سومو في سرطان الكبد التي قد توفر آلية علاجية محتملة.
