ישויות מחייבות SUMO מאפשרות לבודד חלבוני SUMOylated אנדוגניים ב- vivo. זה די מאתגר בשל נוכחותו של פרוטאז פעיל ספציפי SUMO ואת החלקים הנמוכים של חלבוני SUMOylated ב vivo. הבידוד של הפרוטם SUMOylated באמצעות ישויות מחייבות SUMO הוא יתרון כפי שהוא דוחה את הגידול בזיקה הכוללת עבור מצעים SUMO.
זאת בשל העובדה כי SUBEs נפוצים חלבונים המרכיבים חזרות טנדם של SIMs ובכך לזהות מולקולות SUMO במיוחד על חלבונים שונה. השימוש בישויות מחייבות SUMO לבידוד ואפיון הפרוטם SUMOylated בסרטן הכבד הוא שיטה מהירה ורגישה. הוא מספק מידע מהעבר על התפקיד הלא ידוע למדי של מסלול SUMOylation בסרטן הכבד בגישה טיפולית פוטנציאלית.
ישויות מחייבות SUMO יכולות לשמש לבידוד ואפיון הפרוטום SUMOylated ברקמות אחרות מלבד הכבד, הן מדגימות אנושיות והן מדגמים מן החי, כמו גם במספר מודלים תאיים. למרות טכניקה זו היא קלה לביצוע, יש לנקוט בזהירות בעת ניתוח מספר דגימות באותו סוג. קוביה קרירה יותר למספר השלבים המעורבים.
לכן, אנו ממליצים על החלקה זהירה של הצינורות לפני תחילת הניסוי. ההדגמה החזותית של השימוש בישויות מחייבות SUMO מקלה על מהפכת פרוטוקול זה במיוחד בשל קשיי הטיפול בסיביות ואובדן החומר במהלך הפרוטוקול. תאי הפאטומה אנושיים הוכנו בעבר על ידי ציפוי תאים בצלחות P100 בצפיפות של 1.2 עד 1.5 מיליון תאים למנה ושומרים עליהם במדיית צמיחה סטנדרטית ב-37 מעלות צלזיוס.
כאשר מוכנים להשתמש בתאים, שאפו את המדיה מהצלחות ושטפו אותם בחמישה מילימטרים של PBS סטרילי. שים את הצלחת על קרח ולהוסיף 500 microliters של חיץ תיזה בתוספת על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן השתמש מגרד תאים כדי לגרד בעדינות את התאים מתחתית הצלחת לתוך מדיום תזה.
לחלופין, לקצור את התאים על ידי טריפסיניזציה ולהוסיף מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA לצלחת לוודא כי התאים מכוסים. שים את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לאפשר להם להתנתק מהצלחת, ולאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה מחומם מראש כדי לעצור את טריפסיניזציה. צנטריפוגה התאים ב 150 פעמים G במשך 10 דקות ושואפים את supernatant.
לאחר מכן לשטוף את התאים עם PBS וצנטריפוגה במשך 10 דקות נוספות. שאפו את העל-טבעי והוסיפו 500 מיקרוליטרים של מאגר תיזה. צנטריפוגה תאי לוז ב 15000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatants לצינור טרי להשליך את גלולה.
כאשר מוכן להשתמש בכבדי העכבר שנקטפו, הומוגניזציה 75 מיליגרם של שברים קפואים טריים או נשבר במיליליטר אחד של חיץ תמוגה קר כקרח. הפעל את homogenizer על פי הוראות כתב היד. לאחר הומוגניזציה של רקמות, צנטריפוגה הדגימות ב 15000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי ומשליכים את גלולת הכדור. הכינו גם גם 1 מיליליטר מים מיונים ל-70 מיליגרם של חרוזים ושיקמו אותם בן לילה בארבעה סלזיוס. לאחר נפיחות, לשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מים מיוננים או PBS, צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות לאחר כל לשטוף.
לאחר הכביסה, תן שימוש חוזר גם במיליליטר אחד של PBS כדי לקבל תרחיף של 50% עבור כל דגימה ב-100 מיקרוגרם של GST-SUBEs או בקרת GST ל-100 מיקרוליטר של תרחיף גם גם פרעוש הגלוטתיון ו-500 מיקרוליטר של PBS. הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס לפחות שעתיים תוך כדי סיבוב, ואז לשחזר את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות resuspend אותם PBS. קח 10% מהתא שהוכן קודם לכן lysate ולדלל אותו באמצעי אחסון שווה של מאגר רותח 3X.
מוסיפים 450 מיקרוליטרים של ליזט מובהר ל-100 מיקרוליטרים של תרחיף חרוז הגלוטתיון. דגירה ליסט עם חרוזים בארבע מעלות צלזיוס לפחות שעתיים תוך סיבוב איטי. לאחר הדגירה, לסובב את חרוזים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות ולאסוף את supernatant לניתוח.
העבר 10% מאמצעי האחסון הכולל לצינור נפרד והוסף נפח שווה של מאגר רותח 3X. לשטוף את המדגם הנותר שלוש פעמים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS קר כקרח עם 05% Tween 20 ולסובב אותו למטה ב 300 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. בזהירות שאף את העל-טבעי כדי לוודא שלא נשאר נוזל.
לאחר מכן לחמק המדגם עם 15 microliters של חיץ רותחים 3X ו 15 microliters של מאגר תיזה. הפעל ניתוח כתם מערבי על פי הוראות כתב היד. אם אתם מבצעים ספקטרומטריית מסה, התפלו את הפפטידים באמצעות מיקרוקולומלונים C18 עם קצה במה והתינו אותם מחדש בחומצה אטומית של 0.1% לפני הניתוח.
טען את הדגימות למערכת LC-MS ונתח אותן ב- triplicate. המשך בזיהוי חלבונים וחישוב שפע באמצעות התוכנה המשויכת. בצע ניתוח סטטיסטי בהתאם לכיווני כתב היד.
פרוטוקול זה שימש כדי לבודד חלבונים SUMOylated בעכברים עם מחסור גליצין N-מתילטרנספראז אשר גורם להתפתחות ספונטנית של סרטן הכבד ואת המלטה סוג הבר שלהם. כתמי Ponceau S בוצעו על הקלט, זרימה דרך, ושברים כבולים מן ה- SUBEs למשוך למטה תבוצע. ניתוח כתם מערבי של LKB1 שנתפסו עם SUBEs מראה כי רמות LKB1 SUMOylation מוגברים גידולים בכבד.
תאי הפאטומה אנושיים ותאי אפיתל בכבד שאינם משתנים שימשו כדי לחקור את היכולת של מלכודת SUMO לקיים אינטראקציה עם חלבונים עם SUMOylated באופן טבעי. ראשית, כתמי חלבון קונבנציונליים שימשו כדי לדמיין את החומר הכולל שנתפס עם SUBEs. ואז Mass-Spectrometry הראה כי 742 חלבונים הועשרו בדגימה SUBEs תא הפאטומה ו 577 הועשרו בכבד אפיתל תאים שאינם משתנים SUBEs מדגם.
בעת ביצוע ניסויים עם SUBEs, חשוב לשמור על תאים ורקמות על קרח ולהוסיף מיליליטר ספציפי למאגר תיזה על מנת לשמור על הטוהר של SUMOylated. לאחר הדמיה של הפרוטום SUMOylated עם SUBEs, אנו יכולים למצוא את האפיון באמצעות ניתוח כתם מערבי או ספקטרומטריית מסה. היישום של SUBEs לבודד ולאפיין את הפרוטום SUMOylated ברקמות סרטן הכבד ותאי הפאטומה סולל את הדרך לחקור את התפקיד של השינויים שלאחר התרגום של SUMO בסרטן הכבד אשר עשוי לספק מנגנון טיפולי פוטנציאלי.
