SUMO-bindende Einheiten ermöglichen es, endogene SUMOylated-Proteine in vivo zu isolieren. Dies ist aufgrund des Vorhandenseins von aktiver SUMO-spezifischer Protease und der geringen Fraktionen von SUMOylated Proteinen in vivo ziemlich herausfordernd. Die Isolierung des SUMOylated-Proteoms durch die Verwendung von SUMO-bindungden Einheiten ist vorteilhaft, da sie eine Erhöhung der Gesamtaffinität für SUMO-Substrate verzögert.
Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass SUBEs häufig in Proteinen sind, die Tandemwiederholungen von SIMs umfassen und dadurch speziell SUMO-Moleküle auf modifizierten Proteinen erkennen. Die Verwendung von SUMO-bindenden Einheiten zur Isolierung und Charakterisierung des SUMOylated-Proteoms bei Leberkrebs ist eine schnelle und empfindliche Methode. Es liefert vergangene Informationen über die eher unbekannte Rolle des SUMOylierungswegs bei Leberkrebs in einem potenziellen therapeutischen Ansatz.
SUMO-bindende Einheiten können verwendet werden, um das SUMOylated-Proteom in anderen Geweben neben der Leber zu isolieren und zu charakterisieren, sowohl von menschlichen Proben und Tiermodellen, als auch in mehreren Zellmodellen. Obwohl diese Technik einfach durchzuführen ist, sollte bei der Analyse mehrerer Proben desselben Typs Vorsicht geboten sein. kühleren Würfel zu den verschiedenen Schritten beteiligt.
Daher empfehlen wir eine sorgfältige Abgleich der Rohre, bevor Sie dieses Experiment starten. Die visuelle Demonstration des Einsatzes von SUMO-bindenden Einheiten erleichtert die Revolution dieses Protokolls, insbesondere aufgrund der Schwierigkeiten beim Umgang mit den Bits und des Materialverlustes während des Protokolls. Menschliche Hepatomzellen wurden zuvor durch Plattieren von Zellen in P100-Platten mit einer Dichte von 1,2 bis 1,5 Millionen Zellen pro Schale hergestellt und in Standard-Wachstumsmedien bei 37 Grad Celsius gehalten.
Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu verwenden, saugen Sie die Medien von den Platten und waschen Sie sie mit fünf Millimetern sterilen PBS. Legen Sie die Platte auf Eis und fügen Sie 500 Mikroliter Lysepuffer nach den Manuskriptrichtungen ergänzt. Dann verwenden Sie einen Zellkratzer, um die Zellen von der Unterseite der Platte vorsichtig in das Lysemedium zu kratzen.
Alternativ können Sie die Zellen durch Trypsinisierung ernten und einen Milliliter Trypsin-EDTA auf die Platte geben, um sicherzustellen, dass die Zellen abgedeckt sind. Legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius Inkubator für fünf Minuten, damit sie von der Platte lösen können, dann fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Wachstumsmedium, um die Trypsinisierung zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 150 mal G und aspirieren Sie den Überstand.
Dann waschen Sie die Zellen mit PBS und Zentrifuge für weitere 10 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Lysezellen bei 15000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten, übertragen Sie dann die Überräube in ein frisches Rohr und entsorgen Sie das Pellet.
Wenn Sie bereit sind, die geernteten Mausleber zu verwenden, homogenisieren Sie 75 Milligramm frische oder geschnappte gefrorene Fragmente in einem Milliliter eiskalten Lysepuffer. Führen Sie den Homogenisator entsprechend den Manuskriptanweisungen aus. Nach der Gewebehomogenisierung zentrieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 15000 mal G und vier Grad Celsius.
Den Überstand in ein frisches Rohr geben und das Pellet entsorgen. Bereiten Sie Glutathionperlen vor, indem Sie 70 Milligramm Perlen einen Milliliter entionisiertes Wasser hinzufügen und sie über Nacht bei vier Degress Celsius rekonstituieren. Nach dem Anschwellen die Perlen dreimal mit 10 Milliliteren entionisiertem Wasser oder PBS waschen, zentrifugieren bei 300 mal G für fünf Minuten nach jeder Wäsche.
Nach den Waschungen die Perlen in einem Milliliter PBS wieder aussetzen, um eine 50%Schlämme für jede Probe bei 100 Mikrogramm GST-SUBEs oder GST-Kontrolle auf 100 Mikroliter der Glutathion-Perlenschlämme und 500 Mikroliter PBS zu erhalten. Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius für mindestens zwei Stunden beim Drehen, dann erholen Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 300 mal G für fünf Minuten und setzen Sie sie in PBS wieder auf. Nehmen Sie 10% des zuvor vorbereiteten Zelllysats und verdünnen Sie es in einem gleichen Volumen von 3X Siedepuffer.
450 Mikroliter des geklärten Lysats zu 100 Mikrolitern der Glutathion-Perlenschlämme hinzufügen. Das Lysat mit den Perlen bei vier Grad Celsius mindestens zwei Stunden lang inkubieren, während es sich langsam dreht. Nach der Inkubation die Perlen bei 300 mal G für fünf Minuten herunterdrehen und den Überstand für die Analyse sammeln.
Übertragen Sie 10 % des Gesamtvolumens in ein separates Rohr und fügen Sie ein gleiches Volumen von 3X Siedepuffer hinzu. Waschen Sie die verbleibende Probe dreimal, indem Sie einen Milliliter eiskalteS PBS mit 05%Tween 20 hinzufügen und sie bei 300 mal G und vier Grad Celsius für eine Minute nach unten drehen. Achten Sie vorsichtig auf den Überstand, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit verbleibt.
Dann die Probe mit 15 Mikroliter 3X Siedepuffer und 15 Mikroliter Lysepuffer. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse entsprechend den Manuskriptrichtungen durch. Wenn Sie die Mass-Spektrometrie durchführen, entsalzen Sie die Peptide mit Stufenspitzen-C18-Mikrosäulen und setzen Sie sie vor der Analyse in 0,1% Ameisensäure wieder aus.
Laden Sie die Proben auf ein LC-MS-System und analysieren Sie sie in dreifacher Ausfertigung. Fahren Sie mit der Proteinidentifikation und Abundance-Berechnung mit der zugehörigen Software fort. Führen Sie statistische Analysen gemäß den Manuskriptrichtungen durch.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um SUMOylated Proteine bei Mäusen mit Glycin N-Methyltransferase-Mangel zu isolieren, die spontane Entwicklung von Leberkrebs und ihre wilden Art Littermate verursacht. Ponceau S Färbung wurde auf der Eingabe durchgeführt, Durchfluss, und BOUND-Fraktionen aus dem SUBEs Pull-down-Assay. Die Western Blot-Analyse von LKB1, die mit SUBEs erfasst wurde, zeigt, dass die LKB1-SUMOylierung bei Lebertumoren erhöht wird.
Menschliche Häpatomzellen und nicht transformierte Leberepithelzellen wurden verwendet, um die Fähigkeit der SUMO-Falle zu untersuchen, mit natürlich sUMOylated Proteinen zu interagieren. Zunächst wurde die konventionelle Proteinfärbung verwendet, um das gesamte Material zu visualisieren, das mit SUBEs aufgenommen wurde. Dann zeigte die Mass-Spektrometrie, dass 742 Proteine in der Sube-Probe der Häpatom-Zelle und 577 in der Leberepithel-Subtransformien-SUBEs-Probe angereichert wurden.
Bei Experimenten mit SUBEs ist es wichtig, Zellen und Gewebe auf Eis zu halten und dem Lysepuffer spezifische Milliliter hinzuzufügen, um die Reinheit von SUMOylated zu erhalten. Nach der Visualisierung des SUMOylated-Proteoms mit SUBEs können wir die Charakterisierung entweder mithilfe der Western-Blot-Analyse oder der Massenspektrometrie finden. Die Anwendung der SUBEs zur Isolierung und Charakterisierung des SUMOylated-Proteoms in Leberkrebsgeweben und Häpatomzellen ebnet den Weg, um die Rolle der posttranslationalen Modifikationen von SUMO bei Leberkrebs zu erforschen, die einen potenziellen therapeutischen Mechanismus bieten können.
