SUMO結合性エンティティは、生体内で内因性のSUMOylate化タンパク質を単離することを可能にする。これは、活性なSUMO特異的プロテアーゼの存在と、生体内のSUMOylatedタンパク質の低分画により、かなり困難です。SUMO結合性エンティティを用いたSUMOのタンパク質の分離は、SUMO基質に対する全体的な親和性の増加を遅らさせるため有利である。
これは、SIのタンデム反復を含むタンパク質に共通のSubEsが存在するため、改変タンパク質に特異的にSUMO分子を認識します。SUMO結合エンティティを肝臓癌におけるSUMOylatedプロテオームの単離および特性評価に使用することは、迅速かつ敏感な方法である。これは、潜在的な治療アプローチにおける肝臓癌におけるSUMOylation経路のかなり未知の役割に関する過去の情報を提供する。
SUMO結合体は、ヒトの標本や動物モデルの両方から、またいくつかの細胞モデルから、肝臓以外の他の組織でSUMOylatedプロテオームを分離し、特徴付けるために使用することができます。この手法は簡単に実行できますが、同じ種類の複数のサンプルを分析する場合は注意が必要です。いくつかのステップにクーラーキューブ。
そのため、この実験を開始する前にチューブを慎重に平準化することをお勧めします。SUMO結合エンティティの使用の視覚的なデモンストレーションは、特に、プロトコル中にビットを処理する困難と材料の損失のために、このプロトコルの革命を容易にします。ヒト肝腫細胞は、P100プレートの細胞を1皿あたり1.2~150万個の密度でめっきして、37°Cの標準成長培地に維持してきました。
細胞を使用する準備ができたら、プレートから培地を吸引し、滅菌PBSの5ミリメートルでそれらを洗浄します。氷の上にプレートを置き、原稿の指示に従って補足された500マイクロリットルのリシスバッファーを追加します。その後、セルスクレーパーを使用して、プレートの底から細胞をそっと擦り落とし、リシス培地に入ります。
あるいは、トリプシン法で細胞を収穫し、細胞が覆われていることを確認するプレートにトリプシン-EDTAの1ミリリットルを加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに5分間入れてプレートから取り外しできるようにし、2ミリリットルの事前温め成長培地を加えてトリプシンを止めます。150回Gで細胞を10分間遠心し、上清を吸引する。
その後、PBSと遠心分離機でさらに10分間細胞を洗います。上清を吸引し、500マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。15000倍Gで、摂氏4度で10分間のリーゼ細胞を遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。
収穫されたマウスの肝臓を使用する準備ができたら、氷冷ライシスバッファーの1ミリリットルで新鮮またはスナップされた凍結断片の75ミリグラムを均質化します。原稿の指示に従ってホモジナイザーを実行します。組織均質化後、試料を15000倍Gで遠心し、摂氏4度で10分間遠心する。
上清を新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。70ミリグラムのビーズに1ミリリットルの脱イオン水を加え、4つのデグレス摂氏で一晩再構成して、グルタチオンビーズを準備します。膨潤した後、10ミリリットルの脱イオン水またはPBSでビーズを3回洗浄し、各洗浄後5分間300倍Gで遠心分離する。
このビールを1ミリリットルで再懸濁し、100マイクログラムのGST-SUBEsまたはGSTコントロールで各サンプルに対して50%スラリーを得て、グルタチオンビーズスラリーの100マイクロリットルおよびPBSの500マイクロリットルを得る。回転しながら少なくとも2時間摂氏4度で混合物をインキュベートし、その後、5分間Gの300倍で遠心分離によってビーズを回収し、PBSで再中断する。以前に調製した細胞の10%を取り、3倍の沸騰バッファーの等量で希釈します。
450マイクロリットルの清浄化されたライセートを100マイクロリットルのグルタチオンビーズスラリーに加えます。ゆっくりと回転しながら、少なくとも2時間、ビーズを摂氏4度でインキュベートします。インキュベーション後、ビーズをGの300倍5分間回転させ、上清を回収して分析します。
総体積の10%を別のチューブに移し、等量の3倍の沸騰バッファーを追加します。残りのサンプルを05%Tween 20で1ミリリットルの氷冷PBSを加え、300倍Gと摂氏4度で1分間回転させて3回洗浄します。上清を慎重に吸引し、液体が残らないようにします。
次に、3X沸騰バッファーの15マイクロリットルと15マイクロリットルの溶菌バッファーでサンプルを溶出します。原稿の指示に従って、ウェスタンブロット分析を実行します。質量分析を行う場合は、ステージチップC18マイクロカラムを使用してペプチドを脱塩し、分析前に0.1%ギ酸に再懸濁します。
LC-MS システムにサンプルをロードし、三重で分析します。関連ソフトウェアを使用して、タンパク質の同定と豊富な計算を進めます。原稿の指示に従って統計解析を行う。
このプロトコルは、グリシンN-メチルトランスレーゼ欠乏症を有するマウスのSUMOylatedタンパク質を分離するために使用されており、肝臓癌および野生型のごみを自発的に発症する原因となっている。Ponau S染色は、入力、フロースルー、およびSUBEsプルダウンアッセイからのBOUNDフラクションで行った。SubEsで捕捉されたLKB1のウェスタンブロット分析は、LKB1 SUMOylationのレベルが肝腫瘍で増強されていることを示している。
ヒト肝細胞および非形質肝上皮細胞を用いて、SUMOトラップが天然のSUMOylate化タンパク質と相互作用する能力を調べた。まず、従来のタンパク質染色を用いて、SubEsで捕捉された全材料を可視化した。その後、質量分析法は、742タンパク質が肝細胞SUBEサンプルで濃縮され、577タンパク質が肝臓上皮非形質細胞SUBEサンプル中に濃縮されたことを示した。
SUBEを用いて実験を行う場合、SUMOylatedの純度を維持するためには、氷上の細胞や組織を維持し、特定のミリリットルをリシスバッファーに加えておく必要があります。SUBEを用いたSUMOylate化プロテオームの可視化後、ウェスタンブロット分析または質量分析法のいずれかを使用して特性評価を見つけることができます。SEを肝臓癌組織および肝細胞におけるSUMOylatedプロテオームを単離し、特徴付ける応用は、潜在的な治療メカニズムを提供する可能性のある肝癌におけるSUMOの翻訳後修飾の役割を探求する道を開いている。
