على النقيض من الكائنات الحية الهوائية ، تتطلب الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية البحتة عدم وجود الأكسجين. كما الأكسجين في كل مكان في الهواء، والحفاظ على ظروف خالية من الأكسجين أثناء الزراعة هو شرط مسبق للزراعة اللاهوائية. وتمثل التقنية التطبيقية طريقة بسيطة وغير مكلفة لتوفير ظروف أنوكسي لزراعة مجموعة من الميكروبات المختلطة في الثقافة السائلة.
ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية لزراعة الثقافات النقية. ومع ذلك، بالنسبة للكائنات الدقيقة الحساسة عالية الأكسجين، قد لا يكون هذا الإجراء قابلاً للتطبيق. ابدأ بوزن المكونات المتوسطة في قارورة مناسبة، وحلها بنصف حجم الماء المقطر.
ثم، إضافة ملليلتر من مؤشر REDOX، تليها الفيتامينات في حل العنصر النزر. ضبط درجة اله PH وفقا لمتطلبات الكائنات الحية، وتقديم حجم النهائي إلى 1 لتر مع الماء المقطر. لون مؤشر REDOX يعتمد على درجة الH، وقد يتطلب بعض الوقت للتكيف.
تعبئة 120 ملليلتر قارورة المصل مع 50 ملليلتر من المتوسط، ثم احتضان لهم في حمام مائي 100 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة، للحد من ذوبان الأكسجين في مرحلة السائل. قم بتدفق مساحة الرأس بالنيتروجين. رعاية التهوية المناسبة للغرفة عند العمل مع النيتروجين.
إغلاق القارورة مع غشاء المطاط بوتيل، وإصلاح قبعات الألومنيوم. بعد ذلك، أضف 0.1 ملليلتر من العامل المتناقص إلى كل قارورة، لتقليل إمكانات REDOX. و أُدَمّ القارورة لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية
وautoclave مصدقة لتعقيم السفن المغلقة يجب أن تستخدم عند تطبيق هذا البروتوكول. خلاف ذلك، قد يسبب الضغط الزائد المستمدة من زيادة درجة الحرارة قارورة المصل لتنفجر. لإعداد inoculum من هاضم اللاهوائية، إضافة 400 ملليلتر من الماء المقطر إلى قارورة وتقديمها إلى الغليان.
تبريده إلى ما يقرب من 30 درجة مئوية في حين التنظيف بشكل دائم في الفضاء الرأس مع النيتروجين. إضافة ما يقرب من 100 غرام من الحمأة، المستمدة من هاضم اللاهوائية، مع التأكد من سجلات الكتلة الدقيقة للحمأة لتحديد التخفيف. تبادل مساحة رأس القارورة مع النيتروجين، وإغلاقه مع الحاجز المطاطي بوتيل.
اصافح القارورة لمدة 30 دقيقة عند 120 دورة في الدقيقة. السماح لجسيمات الحمأة الأكبر بالرواسب، ثم استخدام حقنة و canula لإزالة 5 ملليلتر من inoculum وحقنها في قارورة مصل معدة مسبقا. احتضن قارورة المصل تلقيح في درجة حرارة مناسبة للتجربة، مع التأكد من استنزاف الضغط على مدى الناجمة عن زيادة درجة الحرارة، ما يقرب من 15 إلى 30 دقيقة بعد بدء الحضانة.
لتقييم إنتاج الغاز الحيوي وتكوينه خلال فترة الحضانة، تسجيل الضغط الجوي الحالي وإعداد مقياس لقياس الضغط داخل القارورة. يهز القارورة وإزالة 1 ملليلتر من غاز الفضاء رئيس باستخدام الحقنة والكنب. قياس الهيدروجين والأكسجين والميثان، وتركيز ثاني أكسيد الكربون باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية.
استخدم 1 ملليلتر من السائل من القارورة لمراقبة تركيزات جميع الأحماض الدهنية الطويلة ، وفقًا لتوجيهات المخطوطات ، واستنزاف القارورة فوق الضغط بعد إعادتها إلى درجة الحرارة المناسبة. تم استخدام هذا البروتوكول لإنشاء المفاعلات الحيوية المصغرة التي تجري الهضم اللاهوائي. تمت إضافة التربتوفان، والتيروسين، الفينيلانين، واستخراج اللحوم، والكزيلين في 3 تركيزات مختلفة، وتم رصد إنتاج الميثان على مدى فترة حضانة 28 يوما.
تم تصور الميثانولونات عن طريق إشعاع الإنزيم المشارك F420 ، وهو ناقل إلكترون في تكوين الميثانول ، ويعرض الفلورس الأزرق والأخضر مع أقصى امتصاص في 420 نانومتر. وبالتزامن مع تحليل الغاز، تم تحليل العينات من أجل الأحماض الدهنية المتطايرة، وتركيزات حمض الفينيل خلال فترة الحضانة. يمكن تطبيق الطرق البيولوجية الجزيئية التي تستهدف وفرة الكائنات الدقيقة المحددة و /أو تكوين المجتمع الميكروبي ، في مرحلة معينة من التجربة ، باستخدام الإجراء الموصوف.
