В отличие от аэробных организмов, строго анаэробные микроорганизмы требуют отсутствия кислорода. Поскольку кислород повсеместно находится в воздухе, сохранение условий, свободных от кислорода во время культивирования, является предпосылкой для анаэробного культивирования. Применяемый метод представляет собой простой и недорогой метод для обеспечения аноксических условий для выращивания смешанной микробной популяции в жидкой культуре.
Этот метод также может быть применен для выращивания чистых культур. Однако для высокочувствительных к кислороду микроорганизмов эта процедура может быть не применима. Начните с взвешивания средних ингредиентов в соответствующей колбе и растворив их с половиной объема дистиллированной воды.
Затем добавьте миллилитр индикатора REDOX, за которым последуют витамины в растворе микроэлементов. Отрегулируйте рН в соответствии с требованиями организма и доввейте конечный объем до 1 литра дистиллированной водой. Цвет индикатора REDOX зависит от рН и может потребовать некоторого времени для настройки.
Заполните 120 миллилитров сыворотки колбы с 50 миллилитров среды, а затем инкубировать их в 100 градусов по Цельсию водяной бане в течение 20 до 30 минут, чтобы уменьшить solubility кислорода в жидкой фазе. Промыть пространство головы азотом. Позаботьтесь о соответствующей вентиляции комнаты при работе с азотом.
Закройте колбы с бутил резиновой септой, и исправить алюминиевые колпачки. Затем добавьте 0,1 миллилитров уменьшаемого агента к каждой колбе, чтобы еще больше уменьшить потенциал REDOX. И автоклав колбы в течение 20 минут при 121 градусов по Цельсию.
При применении этого протокола необходимо использовать автоклав, сертифицированный для стерилизации закрытых судов. В противном случае чрезмерное давление, полученное в результате повышения температуры, может привести к взрыву фляг сыворотки. Для приготовления инокулы из анаэробного реактора добавьте в колбу 400 миллилитров дистиллированной воды и довлейте ее до кипения.
Охладить его примерно до 30 градусов по Цельсию, постоянно промывая пространство головы азотом. Добавьте около 100 граммов шлама, полученного из анаэробного реактора, убедившись, что записывает точную массу шлама для определения разбавления. Обменять головное пространство колбы азотом и закрыть его с помощью бутыльной резиновой перегородки.
Встряхните колбу в течение 30 минут при 120 об/мин. Пусть большие частицы шлама отложений, а затем использовать шприц и канулу, чтобы удалить 5 миллилитров инокулума и ввести его в ранее подготовленную колбу сыворотки. Инкубировать привитой колбе сыворотки при соответствующей температуре для эксперимента, убедившись, что слить над давлением, вызванным повышением температуры, примерно через 15 до 30 минут после начала инкубации.
Оценить добычу и состав биогаза во время инкубации, зафиксировать текущее атмосферное давление и подготовить манометр для оценки давления внутри колбы. Встряхните колбы и удалите 1 миллилитр головного космического газа с помощью шприца и канулы. Измерьте концентрацию водорода, кислорода, метана и двуокиси углерода с помощью газовой хроматографии.
Используйте 1 миллилитр жидкости из колбы для мониторинга концентрации всех высоких жирных кислот, в соответствии с рукописными указаниями, и слейте колбы над давлением после возвращения его к соответствующей температуре. Этот протокол был использован для создания миниатюрных биореакторов, проводящих анаэробные пищеварения. Триптофан, тирозин, фенилаланин, экстракт мяса и кейсин были добавлены в 3 различных концентрациях, а производство метана контролировалось в течение 28-дневного инкубационного периода.
Метаногены визуализировались путем излучения коэнзима F420, который является носителем электронов в метаногенезе, и демонстрирует сине-зеленую флуоресценцию с максимальным поглощением на 420 нанометров. Параллельно с анализом газа были проанализированы образцы летучих жирных кислот и концентраций фениловой кислоты в инкубационный период. Молекулярные биологические методы, направленные на обилие конкретных микроорганизмов и/или состав микробного сообщества, в определенный момент эксперимента могут применяться с помощью описанной процедуры.
