Em contraste com organismos aeróbicos, microrganismos estritamente anaeróbicos requerem a ausência de oxigênio. Como o oxigênio é onipresente no ar, reter condições livres de oxigênio durante o cultivo é um pré-requisito para a cultura anaeróbica. A técnica aplicada representa um método simples e barato para fornecer condições anoxidas para cultivar uma população microbiana mista na cultura líquida.
Essa técnica também pode ser aplicada para o cultivo de culturas puras. No entanto, para microrganismos altamente sensíveis ao oxigênio, este procedimento pode não ser aplicável. Comece pesando ingredientes médios em um frasco apropriado, e dissolvendo-os com metade do volume de água destilada.
Em seguida, adicione mililitro do indicador REDOX, seguido de vitaminas na solução de elemento de rastreamento. Ajuste o pH de acordo com as exigências do organismo e leve o volume final para 1 litro com água destilada. A cor do indicador REDOX é dependente de pH, e pode exigir algum tempo para se ajustar.
Encha frascos de soro de 120 mililitros com 50 mililitros de médio e, em seguida, incuba-os em um banho de água de 100 graus Celsius por 20 a 30 minutos, para reduzir a solubilidade do oxigênio na fase líquida. Lave o espaço da cabeça com nitrogênio. Cuide da ventilação adequada da sala ao trabalhar com nitrogênio.
Feche os frascos com septa de borracha butyl e conserte as tampas de alumínio. Em seguida, adicione 0,1 mililitros de agente redutor a cada frasco, para reduzir ainda mais o potencial REDOX. E autoclave os frascos por 20 minutos a 121 graus Celsius.
Uma autoclave certificada para a esterilização de embarcações fechadas deve ser usada na aplicação deste protocolo. Caso contrário, a sobrepressão derivada do aumento da temperatura pode causar a explosão de frascos de soro. Para preparar o inóculo do digestor anaeróbico, adicione 400 mililitros de água destilada a um frasco e leve-o para ferver.
Esfrie-o até aproximadamente 30 graus Celsius enquanto lava permanentemente o espaço da cabeça com nitrogênio. Adicione aproximadamente 100 gramas de lodo, derivado de um digestor anaeróbico, certificando-se de registrar a massa exata da lama para determinação da diluição. Troque o espaço da cabeça do frasco com nitrogênio, e feche-o com um septo de borracha de butílio.
Agite o frasco por 30 minutos a 120 RPM. Deixe sedimentar partículas de lodo maiores, em seguida, usar uma seringa e cânula para remover 5 mililitros de inóculo e injetá-lo em um frasco de soro previamente preparado. Incubar o frasco de soro inoculado a uma temperatura apropriada para o experimento, certificando-se de drenar a pressão sobre causada pelo aumento da temperatura, aproximadamente 15 a 30 minutos após o início da incubação.
Para avaliar a produção e composição de bio gás durante o período de incubação, registo da pressão atmosférica atual e preparar um manômetro para avaliar a pressão dentro do frasco. Agite os frascos e remova 1 mililitro de gás espacial da cabeça usando a seringa e a cânula. Meça a concentração de hidrogênio, oxigênio, metano e dióxido de carbono usando cromatografia gasosa.
Use 1 mililitro de líquido do frasco para monitorar as concentrações de todos os ácidos graxos altos, de acordo com as instruções do manuscrito, e drenar os frascos sobre a pressão depois de devolvê-lo à temperatura apropriada. Este protocolo foi usado para criar bioreatores em miniatura realizando digestões anaeróbicas. Triptofano, tyrosina, fenilalanina, extrato de carne e caseína foram adicionados em 3 concentrações diferentes, e a produção de metano foi monitorada durante um período de incubação de 28 dias.
Os methanogênios foram visualizados irradiando a co-enzima F420, que é um portador de elétrons em methanogênese, e exibe uma fluorescência azul-esverdeada com um máximo de absorção em 420 nanômetros. Simultâneo com a análise de gás, as amostras foram analisadas para ácidos graxos voláteis e concentrações de ácido fenil durante o período de incubação. Métodos biológicos moleculares voltados à abundância de microrganismos específicos e/ou composição da comunidade microbiana, em um determinado ponto do experimento, podem ser aplicados utilizando o procedimento descrito.
