هذه الطريقة يلتقط التفاعلات البروتينية العابرة في الكائنات الحية مثل البكتيريا والخميرة وفي أنواع الخلايا المختلفة. هنا نرصد بشكل عابر تشكيل مجمعات مرافق محددة التي تشارك في بروتيوستاسيس الخلوية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على توليد معلومات عن الديناميات وتوطين شبه الخلوية من جمعيات البروتين في الخلايا prokaryotic والخلايا eukaryotic.
التكيف من هذه التقنية في الكائنات الحية أحادية الخلية مثل البكتيريا والخميرة، ويسمح للباحثين لاستخدامها كأداة قوية للتحقيق في الأمراض المتعلقة بالالتهابات الميكروبية. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحليل تفاعلات البروتين في جميع الكائنات تقريباً عن طريق مجرد تغيير الظروف في مرحلة إعداد العينة من البروتوكول. من المهم اختيار أجسام مضادة ذات نوعية جيدة محددة ومختبرة في إما الكيمياء المناعية، والفلوروسكية المناعية، و ELISA، أو الاعوداد المناعية.
تبدأ قبل علاج الشرائح التشخيص 10 جيدا مع بولي L-ليسين. إضافة 100 microliters من العقيمة وتصفية 0.0001 ٪ بولي - L - ليسين إلى كل بئر ، واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في غطاء محرك تدفق لارينار العقيمة. ثم، يغسل كل بئر مع 50 ميكرولترات من الماء المعقم لإزالة الزائدة بولي-ل-ليسين.
إضافة ما يقرب من 15،000 خلية في البئر اعتمادا على نوع الخلية، وتنمو الخلايا في حاضنة رطبة عقيمة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى 60 إلى 80٪التقاء. بعد 24 ساعة، وإزالة متوسطة النمو عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة كل بئر، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من الطازجة أعدت 4٪ شبهفورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لكل بئر وتحتضن الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
بعد التثبيت ، اغسل الشريحة ثلاث مرات عن طريق غمر الشريحة في جرة تلطيخ الشريحة مع برنامج تلفزيوني. ل Permeabilize أغشية الخلايا المرفقة، غمر الشريحة في 100 ملليلتر من 0.5٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الشرائح ثلاث مرات في TBS-T.
بعد الغسيل الأخير، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد بورق منديل. قم بزراعة خلايا S.cerevisiae وتمييعها وفقًا لتوجيهات المخطوطات، ثم نقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترًا و بيليه بالطرد المركزي بمعدل 665 مرة ز لمدة ثلاث دقائق. إزالة افراط و resuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من المتوسطة الطازجة.
ثم إضافة 550 ميكرولترات من 37٪ الفورمالديهايد لتركيز النهائي من 4٪، واحتضان الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإصلاح الخلايا. بعد الحضانة، بيليه الخلايا، وإزالة عظمى، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من إعداد حديثا 4٪ paraformaldehyde في عازلة الغسيل. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
وفي الوقت نفسه، وإعداد الشرائح التشخيصية عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من 0.0001٪ بولي-L-ليسين حل لكل بئر واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الزائد بولي-L-ليسين مع الماء فائقة الخطورة والسماح للشرائح الهواء الجاف. بعد خطوة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من عازلة غسل عن طريق الطرد المركزي.
إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في مخزن الغسيل. بيليه الخلايا بعد الغسيل الماضي، وإزالة السوبر و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من عازلة غسل تحتوي على 1.2 سوربيتول المولى. لهضم جدار الخلية، بيليه الخلايا مرة أخرى وإعادة تثبيت الخلايا في 250 ميكرولترات من حل Lyticase أعدت حديثا.
احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف. بعد خطوة الهضم، وغسل الخلايا ثلاث مرات في عازلة غسل وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولترات من عازلة غسل تحتوي على 1.2 سوربيتول المول. إضافة 20 ميكرولترات من الخلايا التي أعيد تعليقها إلى كل بولي-L-Lysine المغلفة جيدا, والسماح للخلايا الثابتة و permeabilized إرفاق لمدة 30 دقيقة.
اغسل الآبار ثلاث مرات بـ 50 ميكرولترات من عازل الغسيل لإزالة الخلايا غير المنضمة، وامضي في فحص الربط القربي. بدء عملية فحص الربط القربي، أو بروتوكول جيش التحرير الشعبي، عن طريق إضافة قطرة من العازلة حظر إلى كل بئر واحتضان الشريحة في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. إزالة العازلة حظر عن طريق وضع ورقة منديل على حافة كل بئر، وغسل الخلايا مرتين في 100 ملليلتر من غسل العازلة A.Next، إضافة 40 ميكرولترات من الحل الأجسام المضادة الأولية لكل بئر، واحتضان الشريحة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
إزالة الحل الأجسام المضادة الأولية وغسل الشرائح مرتين في غسل العازلة A.After غسل، إضافة 40 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر واحتضان الشريحة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. ثم إزالة الحل وغسل الشرائح مرتين في غسل العازلة A.Then إضافة 40 ميكرولترات من خليط الحمض النووي الربط الذي يحتوي على موصل oligonucleotides وحامض نووي ligase، إلى كل بئر، وتحتضن الشريحة في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة خليط الربط وغسل الشرائح مرتين مع غسل العازلة A.Add 40 ميكرولترات من خليط التضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي وligonucleotides المسمى فلورية لكل بئر، واحتضان لمدة 100 دقيقة في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية.
إزالة خليط التضخيم وغسل الشرائح في 100 ملليلتر من غسل العازلة B لمدة 10 دقائق لكل غسل. ثم غسل الشرائح في 100 ملليلتر من غسل العازلة B المخفف واحد إلى 100 في المياه فائقة الطهر. إضافة 20 ميكرولترات من DAPI التي تحتوي على تركيب المتوسطة في البئر.
تغطية آبار الشريحة مع زلة الغطاء وختم مع طلاء الأظافر. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لرصد الجمعيات المرافقة العابرة التي تشكلت بين بروتينات J-domain المتميزة وHsp70 مرافق والبروتينات J-domain في HeLa و S.cerevisiae وخلايا الإشريكية القولونية. تم استهداف بروتينات المجال من الفئة البشرية A و B J مع أجسام مضادة أولية محددة للغاية.
كل من الفلورسنت الأحمر puncti يمثل مجمع البروتين شكلت بين اثنين من البروتينات J المجال متميزة في خلايا هيلا. كما لوحظت مجمعات بروتينية من الفئة المختلطة من فئة J في أحادي الخلية eukaryote S.cerevisiae، أو خميرة بيكر. وكان بعض من puncti الفلورسنت ولدت من جيش التحرير الشعبي أكثر صعوبة في حل باعتبارها بؤر الفردية، وذلك بسبب حجم الخلية الصغيرة.
لم يتم ملاحظة التكوين المعقد بين بروتينات المجال من الفئة A و B J في خلايا الإشريكية القولونية ، وهو ما يتفق مع الدراسات الكيميائية الحيوية التي أجريت مع البروتينات النقية. ولكن تم القبض على الجمعيات المرافقة الأخرى التي تنطوي على البروتينات J-المجال وHsp70 مرافق باستخدام بروتوكول جيش التحرير الشعبي. الضوابط التقنية التي تفتقر إلى الأجسام المضادة الأولية ضد واحد من البروتينات J-المجال التفاعل أو المرافقين في ردود فعل جيش التحرير الشعبي كاملة خلاف ذلك أظهرت القليل أو عدم وجود تشكيل puncti الفلوريس في الخلايا، مما يشير إلى عدم وجود تضخيم إشارة إيجابية كاذبة.
للحصول على نتائج موثوقة باستخدام مقايسة ربط القرب، تحقق مسبقا من أن الأجسام المضادة المستخدمة ذات جودة كافية. وعلاوة على ذلك، اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الإفراط في هضم الخلايا التي تحتوي على جدار الخلية.
