이 방법은 박테리아와 효모 와 같은 유기체및 다른 세포 모형에서 일시적인 단백질 상호 작용을 포착합니다. 여기서 우리는 세포 프로테오스타시스에 관여하는 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체를 모니터링합니다. 이 기술의 주요 장점은 대핵 세포및 진핵 세포에서 단백질 어셈블리의 역학 및 세포 소세포 지역화에 대한 정보를 생성하는 능력입니다.
박테리아와 효모 같이 단세포 유기체에 있는 이 기술의 적응은, 연구원이 미생물 감염과 관련있는 질병을 조사하기 위하여 강력한 공구로 그것을 이용하는 것을 허용합니다. 이 기술은 프로토콜의 샘플 준비 단계에서 조건을 단순히 변경하여 거의 모든 유기체에서 단백질 상호 작용을 분석하기 위하여 잠재적으로 이용될 수 있었습니다. 면역히스토화학, 면역형광, ELISA 또는 면역성수량중 하나에서 특이적이고 시험된 양질의 항체를 선택하는 것이 중요합니다.
폴리 L-Lysine와 함께 10웰 진단 슬라이드를 사전 치료하는 것으로 시작합니다. 멸균 및 필터링 된 0.0001 % 폴리 L-Lysine의 100 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 멸균 라미나르 플로우 후드에서 30 분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음, 여분의 폴리 L-리신을 제거하기 위해 멸균 물 50 마이크로 리터로 각각 잘 씻으시다.
세포 유형에 따라 약 15, 000 세포를 잘 추가하고, 멸균 습한 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 60~80%의 수렴성으로 성장시다. 24시간 후, 각 웰의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 성장 배지를 제거하고, PBS의 50 마이크로리터로 세포를 세 번 세척한다. 그런 다음 PBS에 새로 준비된 4%파라포름알데히드50마이크로리터를 각 우물에 추가하고 실온에서 10분 동안 슬라이드를 배양하여 세포를 수정합니다.
고정 후 PBS로 슬라이드 염색 항아리에 슬라이드를 잠급하여 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 부착된 세포의 막을 투과화하기 위해 PBS에서 0.5%트리톤-X100의 100밀리리터에 슬라이드를 잠수하고 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 TBS-T에서 슬라이드를 세 번 씻습니다.
마지막 세척 후 티슈 페이퍼로 과도한 버퍼를 제거합니다. S.cerevisiae 세포를 원고 의 방향에 따라 재배하고 희석한 다음 50 밀리리터 원심분리기 튜브와 펠릿을 3분 동안 665배 g에서 원심분리로 옮긴다. 상체를 제거하고 신선한 배지의 다섯 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 최종 농도4%를 위해 37%의 포름알데히드의 550 마이크로리터를 추가하고 세포를 고치기 위해 실온에서 배양을 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 셀펠릿, 상류제를 제거하고, 세척 버퍼로 새로 준비된 4%파라포름알데히드의 1밀리리터로 펠릿을 재보펜한다. 45 분 동안 실온에서 세포를 배양.
한편, 각 웰에 0.0001%의 폴리-L-Lysine 용액의 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양하여 진단 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 여분의 폴리 L-리신을 초순수물로 씻어내고 슬라이드를 공기 건조하게 합니다. 인큐베이션 단계 후, 원심 분리에 의해 세척 버퍼 의 1 밀리리터로 세포를 두 번 세척.
상체를 제거하고 세척 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다. 마지막 세척 후 세포를 펠렛, 상체를 제거하고 1.2 어어 소르비톨을 포함하는 세척 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단. 세포 벽을 소화하기 위해 세포를 다시 펠릿하고 갓 준비 된 Lyticase 용액의 250 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.
부드러운 흔들림으로 15 분 동안 섭씨 30도에서 세포를 배양하십시오. 소화 단계 후, 세척 버퍼에서 세포를 세 번 세척하고 1.2 어어 소르비톨을 포함하는 세척 버퍼의 250 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 각 폴리 L-Lysine 코팅웰에 다시 중단된 세포의 20 마이크로리터를 추가하고 고정 및 투과 된 세포가 30 분 동안 부착할 수 있도록 합니다.
50 마이크로리터의 세척 버퍼로 우물을 세 번 세척하여 비 부착 세포를 제거하고 근접 결찰 분석으로 진행합니다. 근접 계각 분석, 또는 PLA 프로토콜을 시작하여 각 우물에 블로킹 버퍼를 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다. 각 우물의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 차단 버퍼를 제거하고, 세척 버퍼 A.Next의 100 밀리리터에 세포를 두 번 세척하고, 각 우물에 1 차 항체 용액의 40 마이크로리터를 추가하고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 60 분 동안 슬라이드를 배양합니다.
1차 항체 용액을 제거하고 세척 버퍼 A.에서 슬라이드를 두 번 세척한 후, 각 웰에 이차 항체 용액의 40 마이크로리터를 추가하고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 60분 동안 슬라이드를 배양한다. 그런 다음 용액을 제거하고 세척 버퍼 A.Then에서 슬라이드를 두 번 세척하십시오.다음 커넥터 올리고뉴클레오티드와 DNA 리그가 들어있는 DNA 결찰 혼합물의 40 마이크로리터를 각각 양호한 챔버에 넣고 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다. 인큐베이션 후, 리설주 혼합물을 제거하고 세척 버퍼 A.40 마이크로리터를 DNA 폴리머라제와 형광폴리티드를 각각 양호에 첨가하고, 습한 챔버에서 100분 동안 배양한다.
증폭 혼합물을 제거하고 세척당 10 분 동안 세척 버퍼 B의 100 밀리리터로 슬라이드를 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 버퍼 B의 100 밀리리터로 세척하여 초순수 수에서 1~100을 희석시 세척합니다. 잘 당 DAPI 함유 마운팅 매체20 마이크로리터를 추가합니다.
슬라이드의 우물을 커버 슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오. 이 프로토콜은 HeLa, S.cerevisiae 및 E.coli 세포에서 구별되는 J 도메인 단백질과 Hsp70 샤페론 및 J 도메인 단백질 사이에 형성된 일시적인 샤페론 어셈블리를 성공적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 인간 클래스 A 및 클래스 B J-도메인 단백질은 매우 구체적인 1 차적인 항체로 표적으로 했다.
각각의 적색 형광 펑크는 HeLa 세포에 있는 2개의 명백한 J 도메인 단백질 사이에서 형성된 단백질 복합체를 나타냅니다. 유사한 혼합급 J-도메인 단백질 복합체는 단세포 진핵생물 S.cerevisiae, 또는 제빵사의 효모에서 관찰됩니다. PLA에서 생성된 형광 펑크 중 일부는 작은 세포 크기로 인해 개별 적인 초점으로 해결하기가 더 어려웠습니다.
클래스 A와 B J 도메인 단백질 사이의 복잡한 형성은 정제 된 단백질과 수행 생화학 연구와 일치하는 E.coli 세포에서 관찰되지 않았다. 그러나 J-도메인 단백질과 Hsp70 샤페론을 포함하는 다른 샤페론 어셈블리는 PLA 프로토콜을 사용하여 포착되었다. 그렇지 않으면 완전한 PLA 반응에서 상호 작용하는 J-도메인 단백질 또는 샤페론 중 하나에 대한 1 차항체가 부족한 기술적 제어는 세포에서 형광 천티 형성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았으며, 이는 거짓 양성 신호 증폭의 부족을 나타낸다.
근접 결찰 분석기를 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 사용되는 항체가 충분한 품질인지 미리 확인하십시오. 또한 세포벽을 함유한 세포의 과다 소화를 피하는 예방 조치를 취하십시오.
