دانيلو Maddalo هو حاصل على زمالة بحثية والفريق محقق يونغ (YIG) من معهد كارلسروه للتكنولوجيا.

1. بذر الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن يبدأ الاحماء المتوسطة والثقافة ، وبرنامج تلفزيوني والتربسين 1X في حمام من الماء عند 37 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبق بلطف 5 مل من 1X PBS على خلايا لغسلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني وتطبيق 1X 1 مل من التربسين التي تحتوي على 0025 ٪ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير لوحة بلطف أن يكون هناك توزيع عادل للالتربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الخلايا في الحاضنة في 37 ˚ مئوية لمدة 50-10 دقيقة (اعتمادا على نوع من الخلايا). من وقت للتحقق من الوقت إذا فصل الخلايا عن طريق الهز لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 10-20 مل من المتوسط ​​وجمعها في أنبوب 50 مل الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عداد بيكمان. يجب أن يكون عدد الخلايا تكون كافية لضمان التقاء حوالي 60-70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا وتسمح لهم البذور لمدة 6-8 ساعات. </li></ol> 2. غير المشبعةfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ترنسفكأيشن ، الاحماء an قسامة المصل خالية المتوسطة في حمام الماء عند 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل جين الأبله المتطرفة 9 إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة المتوسط ​​المصل مجانا في أنابيب إيبندورف 2 (1 = 1 ترنسفكأيشن أنبوب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة الجينات الأبله المتطرفة 9 في الاهتمام المتوسطة حرة المصل الذي دفع الطرف لا يلمس حائط من البلاستيك إيبندورف واحتضان لمدة 5 دقائق. في غضون ذلك إعداد يمزج الحمض النووي هما : في أنبوب واحد معا مزيج البلازميدات لrenilla ، يراعة ومكافحة ناقلات الفارغة ، في آخر renilla أنبوب ، ويراعة كوصي الجزيئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مزيج الحمض النووي لكل إيبندورف تحتوي على مصل المتوسطة مجانا + الأبله المتطرفة جين 9 ، واحتضان دوامة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة قطرة كل المزيج على كل لوحة واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 </li></ol> 3. انقسام الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة tryps ، ترنسفكأيشنinize الخلايا كما هو موضح في 1،4-1،6 وتمييع هذه إلى confluency النهائية 60-70 ٪ في لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد واحدة من أجل لوحة تحكم غير بالصدمة وألواح أكبر عدد ممكن من النقاط الزمنية الانتعاش التي يتعين تحليلها ، وأظهرت كما في الشكل. 2. </li></ol> 4. الصدمة الحرارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن الصدمة الحرارية ، قبل الدافئة التي تحتوي على مصل المتوسطة في حمام الماء عند 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد &quot;الصدمة الحرارية العازلة&quot; التي تمييع في المصل سيكلوهيكسيميد المتوسطة التي تحتوي على تركيز لنهائي من 20 ميكروغرام / مل والمماسح إلى 20 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخذ الآن من أصل لوحات من الحاضنة ونضح في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل 1 مل جيدا &quot;الصدمة الحرارية العازلة ، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ˚ C و 5 ​​٪ من ثاني أكسيد الكربون 2 (تشمل أيضا لوحة الإشارة في هذا العلاج). سوف يتوقف هذا دي نوفو تخليق البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون ذلك التبديل في حمام مائي وضبط طنemperature في 45 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، وختم غطاء لوحات Parafilm مع خفض سابقا في المشارب. تبقى الإشارة لوحة (100 ٪ من يراعة refolfed) في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في 45 ˚ مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من حمام المياه ، وإزالة parafilm ووضع لوحات عودة إلى حاضنة للسماح للانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل وقت الحصاد نقطة الخلايا وغسلها في برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي 1X في 2000Xg لمدة 1 دقيقة بمعدل 4 ˚ جيم </li></ol> 5. تحلل الخلية ومقايسة luciferase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحلل الخلايا بكفاءة ، والمفاجئة تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة السلبي 01:05 المخفف في الماء المقطر مزدوجة في أنبوب زجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من lysate الخلية في صفيحة 96 أيضا. هو pipetted كل عينة في ثلاث نسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تستخدم فقط &quot;غير صدم&quot; لعينات مرجعيةقراءة النشاط renilla luciferase ، حيث يتم استخدام هذه الخطوة للتأكد من كفاءة ترنسفكأيشن متساوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول للمقايسة. من أجل حل luciferin تمييع luciferin إلى تركيز النهائي من 0.2 ملم في الغليسين - الغليسين العازلة. لتخفيف رد فعل العازلة DTT و ATP إلى تركيز 1MM النهائي في الغليسين - الغليسين العازلة. العازلة للتفاعل coelenterazine ، تمييع coelenterazine إلى تركيز النهائي من 0.2 ميكرومتر في coelenterazine العازلة. يبقي الحل luciferin والضوء coelenterazine العازلة رد فعل المحمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الآن لوحة 96 - جيدا في luminometer وبدء برنامج &quot;Wallac 1420 محطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض Pump1 في أنبوب يحتوي على الصقر حل coelenterazine. إغلاق الغطاء لذلك لا يمكن للضوء أن تأتي في اتصال مع أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر من القائمة &quot;الصيانة الصيدلي&quot; الخيار والقراد Pump1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخيار &quot;تعبئة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحرير تخطيط لوحة اختيار الخيار &quot;بروتوكول استكشاف ونتائجها&quot; في القائمة. حدد البروتوكول وانقر مرتين على ذلك. اختر الآن أن تكون قراءة الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعود إلى &quot;مدير Wallac&quot; وانقر على &quot;ابدأ&quot;. رد الفعل بين luciferase renilla coelenterazine والركيزة في ضوء تنبعث مع طول موجة الذروة من 482 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القراءة ، والذهاب على &quot;صيانة مصدر&quot; وحدد &quot;فارغة&quot; والافراج عن جميع Pump1 الحل المتبقية مرة أخرى إلى الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نقل أنبوب إلى أنبوب الصقر تحتوي على المياه ووضع علامة &quot;تدفق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خطوة التنظيف ، تفريغ أنبوب عن طريق تحديد &quot;فارغ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب من Pump1 في أنبوب العازلة الصقر رد الفعل واحد من Pump2 في أنبوب الصقر luciferin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير تخطيط لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر &quot;التعبئة&quot; للPump1 وPump2 من دي &#39;سبنسر الصيانة &quot;القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد البروتوكول وبدء القراءة. رد الفعل بين luciferase اليراع وluciferin لها الركيزة تنبعث الضوء مع طول موجة الذروة من 560 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية القراءة تكرار الإجراء الخالي - فلوش ، وإفراغ لPump1 Pump2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج متوفرة الآن في &quot;مستكشف Wallac 1420. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويرتبط كل تجربة لعدد مقايسة ، اسم المستخدم ، تبدأ وتنتهي اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن نتائج يمكن تصديرها كملف اكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء العمليات الحسابية ، وتنقسم الخلايا إلى ثلاث مجموعات : 1. عينات مرجعية غير صدم (كما هو 100 ٪ من refolded يراعة luciferase) ، 2. الخلايا دون كوصي الجزيئية والحرارة بالصدمة ؛ 3. الخلايا مع كوصي الجزيئية والحرارة بالصدمة. </li></ol> 6. ممثل النتائج وهناك علاقة مباشرة refolding البروتين إلى الوقت للانتعاش ولذلك لاختبار إذا كان النظام يعمل الموالية<html> perly ، وهي مقايسة لابد من القيام بجمع الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. ارتباط مباشر الوقت / نسبة refolding يشير إلى أنه قد تم تنفيذ التجربة بشكل صحيح ، ويمثل ذلك عاملا مقيدا. غير أنه ينبغي أن ينظر دائما أن refolding بعد الصدمة الحرارية هو حدث تشبع ، وبالتالي يجب أن يتم تنفيذ دورة تحليل الوقت المناسب قبل البدء في أي تجربة. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 لمحة عامة عن التجربة. في مقايسة refolding فيفو يتطلب 3 إلى 4 أيام ليكتمل. في يوم والمصنفة 1 الخلايا وtransfected. وsplitted الخلايا اليوم التالي في شكل أصغر ويوم 3 هم الحرارة بالصدمة. عند هذه النقطة هو ممكن لتنفيذ مقايسة luciferase اليمين بعد حصاد الخلايا أو لحفظ الخلايا في بيليه -80 درجة مئوية ، وتنفيذ مقايسة في لحظة أخرى _content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. تقسيم الخلية. في يوم 2 يتم تقسيم الخلايا في لوحة 6 - جيدا. وسوف تضعف كل ترنسفكأيشن في بئر من أجل أن يكون كل ترنسفكأيشن على نفس المائدة. وسوف تقابل كل لوحة إلى وقت معين ، بالإضافة إلى استرداد لوحة مرجع غير بالصدمة. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. نتيجة جيدة الممثل. أ النسبة المئوية للقياس refolding مباشرة النشاط يراعة luciferase. كل مخطط شريط يمثل نسبة refolding في غياب (أشرطة سوداء) وبحضور (الحانات الحمراء) من كوصي الجزيئية في مختلف نقاط وقت الاسترداد. باء الارتباط بين الزمن وrefolding في غياب (الخط الأسود) وجود (خط أحمر) من كوصي. قيم ص التربيعية تبين علاقة جيدة. في فايويرد على النتائج g.3A ممثل حيث تم جمع الخلايا 15 دقيقة ، 30 ، 45 ، 60 و 120 بعد الصدمة الحرارية في غياب (القضبان السوداء) وحضور (الحانات الحمراء) من كوصي الجزيئية. النسبة المئوية للزيادة refolded luciferase مع مرور الوقت الطويل والانتعاش مع ترنسفكأيشن من كوصي الجزيئية. ويظهر الترابط بين refolding والوقت لمراقبة (الشكل 3B ، خط أسود) والجزيئية كوصي - transfected الخلايا (الشكل 3B ، خط أحمر). <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. نتيجة سيئة الممثل. أ النسبة المئوية للقياس refolding مباشرة النشاط luciferase. كل مخطط شريط يمثل نسبة refolding في غياب (أشرطة سوداء) وبحضور (الحانات الحمراء) من كوصي الجزيئية في مختلف نقاط وقت الاسترداد. باء الارتباط بين الزمن وrefolding في غياب وحضور (أحمر لالمعهد الوطني للإحصاء) من كوصي. قيم ص التربيعية تبين علاقة سيئة. 4A الرقم. يظهر نتيجة ممثل تجربة لم تنجز بشكل صحيح. كلا لم تحكم (أشرطة سوداء) والجزيئية كوصي - transfected الخلايا (الحانات الحمراء) لم تظهر زيادة في بروتين refolding مع الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، لم ترنسفكأيشن من كوصي الجزيئية لا يؤدي إلى زيادة refolding. ويؤكد هذه العلاقة السيئة في الشكل. 4B تظهر قيمة ص التربيعية 0.6619 0.1882 على التوالي وللتحكم (الخط الأسود) والجزيئية كوصي - transfected الخلايا (خط أحمر).

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في هذا العمل هو تقديم بروتوكولا لقياس نشاط الخلايا refolding من المحرمين الجزيئية. ويمكن إجراء فحص كامل في 3 إلى 4 أيام كما هو مبين من خلال نظرة عامة في الشكل. 1. متانة والخطي من الإشارات الضوئية التي تنتجها يراعة وluciferase renilla تم?...

عن هذه التجربة &quot;الخفيفة المتجهات&#39; إلى Luminometer شكل بيركن إلمر عداد التلألؤ &#39;1420كان يستخدم برامج لLuminometer : Renilla : مضخة 1 ، 100 حقن ميكرولتر رد فعل الاحتياطي : Pump1 ، 70 حقن ميكرولتر Luciferin : Pump2 ، حقن 30μl لمخازن إعداد هذه الحلول الأسهم في الماء المقطر مزدوجة : <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1M MgSO 4 : 246،48 ز MgSO 4 * 7H 2 O في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 0،5 م EGTA : 190،18 ز EGTA في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1M KH 2 ص 4 : 136،09 ز KH 2 PO 4 في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1M K2 هبو 4 : 228،23 ز ك 2 هبو 4 * 3H 2 O في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- كلوريد الصوديوم 5M : 292،2 غرام كلوريد الصوديوم في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 0،5 م EDTA : 186،12 ز EDTA * 2H 2 O في 1 ليتر &nbsp;</li></ul> الغليسين - الغليسين العازلة : <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 25mM Glycylglycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 15mM MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 4mM EGTA </li></ul> 1 لتر للاستخدام 3،3 غرام من Glycylglycin ، 15ml حل MgSO4 1M و8ml حل EGTA 0،5 م. حل في الماء ، وضبط درجة الحموضة إلى 7،8 وتقديمهم إلى إجمالي حجم 1 لتر. العازلة للتفاعل Renilla / Coelenterazine العازلة : <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- وملحوظةس ؛ 13،4 ملي KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 86،6 ملي KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- كلوريد الصوديوم 0،5 M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1MM EDTA </li></ul> 1 مل ليتر 13،4 استخدام 1M KH 2 ص 4 حل ، 86،6 مل من محلول 1M K 2 4 هبو ، 100ML حل كلوريد الصوديوم و5M 2ml حل EDTA 0،5 م. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> شركة </td><td> كتالوج / رقم المنتج : </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco في التعديل النسر متوسطة 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> الجنين الذهب المصل البقري </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td></tr><tr><td> الأبله المتطرفة جين 9 الحمض النووي ترنسفكأيشن الكاشف </td><td> روش </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> اجتماعات الأطراف 3 -- (N - Morpholino) Propanesulfonic حمض </td><td> SIGMA الدريخ </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> سيكلوهيكسيميد </td><td> SIGMA الدريخ </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> الاحتياطي السلبي تحلل 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (4 * MgSO 7H 2 O) </td><td> SIGMA الدريخ روث روث </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 هبو 4 (K 2 هبو 4 * 3H 2 O) كلوريد الصوديوم EDTA </td><td> روث روث روث روث </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin اليراع </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> روث </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> اعبي التنس المحترفين (الأدينوساين ثلاثي) </td><td> روش </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس النشاط الإنزيمي للمرافقين الجزيئية في نظام خلية القاعدة والآثار المحتملة للمركبات مع النشاط المثبطة / محفزة. المحرمين الجزيئية هي البروتينات المشاركة في التنظيم من البروتين للطي (1) ويكون لها دور حاسم في تعزيز بقاء الخلية على الشتائم الإجهاد مثل الصدمة الحرارية 2 والتجويع المغذيات والتعرض للمواد الكيميائية / السموم 3. لهذا السبب تم العثور على المحرمين أن تشارك في المناسبات مثل التنمية الورم ، chemioresistance الخلايا السرطانية فضلا عن 4 5 تنكس عصبي. تصميم جزيئات صغيرة قادرة على تثبيط أو تحفز نشاط هذه الانزيمات وبالتالي واحدة من أكثر الاستراتيجيات درس لعلاج السرطان والاضطرابات العصبية 7 9. في مقايسة الموصوفة هنا توفر إمكانية لقياس النشاط refolding من كوصي على وجه الخصوص والجزيئية لدراسة تأثير شركاتounds على نشاطها. في هذا الأسلوب هو transfected الجين من كوصي الجزيئية التحقيق مع تعبير لناقلات ترميز الجين luciferase يراعة. وقد وصفته بالفعل يمكن denaturated يراعة luciferase refolded بواسطة المحرمين الجزيئية 10،11. كما تطبيع السيطرة ترنسفكأيشن ، يتم ترميز transfected ناقلات للجينات في luciferase renilla. يتم تنفيذ كافة transfections الموصوفة في هذا البروتوكول مع الأبله المتطرفة جين 11 (روش) في خلايا - 293 كلوة الجنين البشري. في الخطوة الأولى ، يتم منع تصنيع البروتين عن طريق علاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد. بعد ذلك يتم بفعل بروتين الصدمة الحرارية التي تتكشف في 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد شفائهم عند 37 درجة مئوية ، ويتم إعادة مطوية البروتينات في التشكل بصورة نشطة ، ويستخدم نشاط luciferase يراعة للقراءة المغادرة : سوف تنتج المزيد من الضوء ، سيكون لديك المزيد من البروتين إعادة التشكل اكتسبت الأصلي. يتم تعيين غير حرارة الخلايا صدمت كمرجع (100 ٪ من refoldedluciferase).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

في هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس البروتين داخل الخلايا refolding بعد الصدمة الحرارية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة foldases مثل المحرمين الجزيئية وتعاونها عوامل أو مركبات قادرة على التأثير على نشاطها. يستخدم يراعة النشاط luciferase كمراسلة لقياس النشاط refolding كوصي.

الخلايا Refolding الفحص

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  Karlsruhe Institute of Technology. في هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس البروتين داخل الخلايا refolding بعد الصدمة الحرارية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة foldases مثل المحرمين الجزيئية وتعاونها عوامل أو مركبات قادرة على التأثير على نشاطها. يستخدم يراعة النشاط luciferase كمراسلة لقياس النشاط refolding كوصي.

Video: Intracellular Refolding Assay

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Aortic Ring Assay

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis assays involve the study of individual endothelial cells in culture conditions (1). The aortic ring assay is an angiogenesis model that is based on organ culture. In this assay, angiogenic vessels grow from a segment of the aorta (modified from (2)). Briefly, mouse thoracic aorta is excised, the fat layer and adventitia are removed, and rings approximately 1 mm in length are prepared. Individual rings are then embedded in a small solid dome of basement matrix extract (BME), cast inside individual wells of a 48-well plate. Angiogenic factors and inhibitors of angiogenesis can be directly added to the rings, and a mixed co-culture of aortic rings and other cell types can be employed for the study of paracrine angiogenic effects. Sprouting is observed by inspection under a stereomicroscope over a period of 6-12 days. Due to the large variation caused by the irregularities in the aortic segments, experimentation in 6-plicates is strongly advised. Neovessel outgrowth is monitored throughout the experiment and imaged using phase microscopy, and supernatants are collected for measurement of relevant angiogenic and anti-angiogenic factors, cell death markers and nitrite.

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from pre-existing vasculature, is associated with both natural and pathological processes. Here we demonstrate an aortic ring assay that allows angiogenic potentiators and inhibitors to be directly added to aortic rings in culture. Sprouting and neovessel outgrowth can be determined by inspecting the aortic rings over a period of 6-12 days.

الأبهر خاتم الفحص

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC الفحص GTPase التنشيط

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

تنقية وRefolding إلى اميلويد الألياف من (صاحب)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged المؤتلف Shadoo البروتين التعبير عن الهيئات إدراج في<em&gt; E. القولونية</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...