النظم الدقيقة الفيزيولوجية لديها القدرة على محاكاة الدوائية والاستجابة السمية من جسم الإنسان لعلاجات محددة من المصالح. النظم الدقيقة الفيزيولوجية لديها القدرة على استبدال الاختبارات الحيوانية حيث أن استخدامها يمكن أن يحسن القدرة التنبؤية للطرق في المختبر ويقلل من تكلفة ووقت الدراسات الدوائية والسمية. قبل 24 ساعة من إدارة المادة الاختبارية، تقسيم 800 ميكرولتر أليكوت من ويليام ES المتوسطة بين المقصورات الأكبر والأصغر من رقاقة الجهاز اثنين، وpirate المتوسطة القاعدية وapical من كل مكافئ حاجز معوي في لوحات البئر المعدة 24.
باستخدام ملقط العقيمة، ودمج إدراج واحد لكل اثنين من الدائرة رقاقة الجهاز في المقصورة أكبر وإضافة 200 ميكرولترات من DMEMS إلى الجانب apical. باستخدام نصائح تحمل واسعة، ودمج 20 مكافئ الكبد لكل دائرة في المقصورة أصغر من رقاقة الجهاز اثنين وربط النظام إلى وحدة التحكم. ثم قم بتوصيل وحدة التحكم بمزود هواء مضغوط وقم بضبط الضغط على 300 بار تقريبًا بالإضافة إلى 300 وتواتر ضخ يبلغ 0.3 هيرتز.
في اليوم التالي تمييع محلول أسيتامينوفين المخزون إلى تركيز 12 ميكرومولار. لتحل محل المتوسطة في النظام، التعرق وسائل الإعلام القاعدية وapical من حاجز المعوي ما يعادل في رقاقة الجهاز اثنين وإضافة 500 ميكرولترات من الثقافة الطازجة المتوسطة المناسبة في المقصورة الكبيرة في الجانب القاعدي العضوي و 300 ميكرولترات إلى المقصورة الصغيرة. بعد التحقق من وجود فقاعات، محاكاة الإدارة عن طريق الفم مع إضافة 200 ميكرولترات من 12 محلول الأسيتامينوفين الدقيقة على الجانب apical من الأمعاء تدرج ثقافة وربط الجهاز microphysiological إلى وحدة التحكم.
جمع حجم إجمالي من الجانبين على حد سواء apical المعوية والبصلة، وكذلك من المقصورة الصغيرة في ثلاثية في النقاط الزمنية المشار إليها. عندما يتم جمع جميع العينات، قم بتعيين جميع المعلمات ذات الصلة لتحليل HPLC كما هو مبين في الجدول وتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء 0.4 ميكرون تحت فراغ. ثم تصفية العينات من خلال 0.22 ميكرون المسام حجم PVDF مرشح حقنة وتخزين العينات في قارورة قبل البدء في قياس الأشعة فوق البنفسجية HPLC.
لتقييم الجدوى العضوية، نقل جميع 20 spheroids من كل تكرار إلى آبار فردية من لوحة 96 جيدا ونقل إدراج ثقافة الخلية إلى الآبار الفردية من لوحة 24 جيدا. غسل مكافئات الأنسجة ثلاث مرات مع DPBS الطازجة في غسل وإضافة 300 ميكرولتر من واحد ملليغرام لكل ملليلتر MTT حل لكل بئر التجريبية. بعد ثلاث ساعات حضانة في حاضنة ثقافة الخلية، استبدال حل MTT مع 200 ميكرولترات من ايزوبروبانول في البئر لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية لاستخراج هشطة MTT من الأمعاء والكبد مكافئات.
في صباح اليوم التالي، نقل 200 ميكرولترات من كل ناظر إلى البئر المناسبة في لوحة 96 بئر وقراءة formazan على قارئ لوحة في 570 نانومتر للسماح بحساب القدرة النسبية للخلايا للحد من MTT باستخدام متوسط الكثافة البصرية لكل نقطة زمنية مقارنة مع التحكم السلبي. للتحليل الخلوي والهظري للعينات، أولاً إصلاح الأمعاء والكبد مكافئات في 4٪ شبهformaldehyde في 0.1 PBS المول لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل organoids خمس مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل، قبل تلطيخ الأمعاء والكبد مع tetramethylrhodamine isothiocyanate phalloidin اليكسا فلور 647 phalloidin لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، نقل العينات إلى تجميد المتوسطة لبضع دقائق قبل المفاجئة تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، استخدم الكريسوستات للحصول على 10 إلى 12 ميكرون سميكة الكبد spheroid المقاطع الجليدية وتركيب أقسام الأنسجة في تصاعد المتوسطة مع DAPI للتصوير عن طريق المجهر الفلوروسية confocal. بالنسبة للميتوكوندريا والتلطيخ النووي، غطي العينات بالكامل بمحلول تلوين الميتوكوندريا لمدة 15 إلى 45 دقيقة في 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
في نهاية الحضانة، بعناية استبدال حل تلطيخ مع 2 إلى 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إصلاح, بلطف شطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمس دقائق لكل غسل قبل وضع العلامات على العينات مع حمض نووي تلطيخ حل العمل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ثلاثة، خمس دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني محمي من الضوء، واستخدام وصمة عار الحمض النووي لتسهيل الكم من عدد من وصمة عار الميتوكوندريا التعبير عن الخلايا على المجهر الفلورسنت مع مجموعات مرشح المناسبة.
دمج حاجز الأمعاء البشرية والكبد ما يعادلها في جهاز microfluidic رقاقة الجهاز يسمح بتقييم الخصائص الدوائية والسمية من العلاجات ذات الاهتمام. بعد العلاج، يمكن تحليل عينات الوسائط من قبل HPLC. يمكن تحليل الأعضاء للتعبير الجيني، وقيم المقاومة الكهربائية عبر الظهارية، والتعبير البروتيني والنشاط، وكذلك لخصائصها المورفولوجية.
يمكن إجراء تحليل MTT لتقييم قابلية الحياة للعضية، وكذلك للكشف عن الأحداث السامة المبكرة جدًا استجابةً لعلاج الأسيتامينوفين. لا يؤثر تدفق الوسائط بشكل كبير على امتصاص الأسيتامينوفين ، في حين أنه يحسن بشكل كبير وظائف مكافئة للكبد ، مما يشير إلى أن امتصاص الأسيتامينوفين المعوي البشري والتمثيل الغذائي الكبدي يمكن محاكاته في هذا النظام الفيزيولوجي الدقيق. 4- ويمكن للنظم الفيزيولوجية الدقيقة أن تحل محل النماذج الحيوانية في تطوير المخدرات واكتشافها لأنها تحاكي بشكل أفضل علم وظائف الأعضاء البشرية ويمكن استخدامها لتعزيز تطوير العقاقير بسرعة أعلى وتكلفة أقل للمخاطر والتعقيدات.
