يمكننا عزل وتجميع البروبيوتيك التي يمكن أن تعزز صحة المرجان وفي الوقت نفسه تخفف من تأثير التلوث ويمكن أن تسهم في استمرار الشعاب المرجانية في العالم المتغير. ويمكن استخدام نهج العزل والفرز الموصوف لاختيار الكائنات المجهرية التي تعرض أنشطة استقلابية رئيسية مثل تحلل الملوثات أو غيرها من الخصائص المفيدة للكائنات البحرية مثل الشعاب المرجانية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لعزل الكائنات الدقيقة قادرة على التحلل أي الملوثات.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مصادر أخرى للمواد في العينات البيئية الأخرى مثل النباتات والتربة والمياه وأي شيء. دراسة الأدب ومحاولة التركيز على سلالات التي يمكن أن تكون جيدة المرشحين لغرض الخاص بك. إذا كان ذلك ممكنا، وتوجيه أساليب العزل لتلك السلالات وتجنب مسببات الأمراض المعروفة.
وإذا كنت تهدف إلى استخدام اتحاد من البكتيريا، من المهم جدا أيضا أن تحقق أولا إذا كان أعضاء الكونسورتيوم لديهم نشاط عدائي ضد بعضهم البعض. ولأن الشعاب المرجانية معرضة لخطر متزايد للانقراض، فقد بدأت هذه المنهجية في جميع أنحاء العالم، وهناك حاجة إلى نشر الطريقة وتوحيدها. وبما أن بعض الباحثين في الشعاب المرجانية ليس لديهم خبرة في علم الأحياء المجهرية التقليدي، فإن هذا هو السبب في أنهم كانوا يطلبون المشورة بشكل متكرر حول كيفية المضي قدماً في مثل هذا النهج.
للبدء، من كل موقع أخذ العينات المستهدفة، واستخدام زجاجات معقمة مع قبعات المسمار لجمع 500 ملليلتر من الماء في ثلاثية. إذا كان تجهيز العينة يحدث في وقت لاحق، والحفاظ على زجاجات في أربع درجات مئوية. استخدام زوج معقمة من كماشة ملقط وقطع شظايا المرجان من نفس موقع أخذ العينات من عينات المياه.
شطف عينة من أجزاء المرجان باستخدام 20 ملليلتر من محلول ملحي معقم بنسبة 3٪أو مياه البحر الاصطناعية للتخلص من البكتيريا الحية الحرة العالقة بشكل فضفاض لمياه البحر. باستخدام ملقط، ضع كل جزء من المرجان في وعاء معقمة مع غطاء المسمار تحتوي على محلول ملحي معقمة. باستخدام ملقط معقمة كماشة، تزن خمسة غرامات من شظايا المرجان في أطباق بيتري العقيمة على مقياس وزنها.
نقل خمسة غرامات من عينة المرجان إلى هاون معقمة وmacerate ذلك باستخدام آفة معقمة. باستخدام ملعقة معقمة، نقل العينة المقشرة إلى قارورة ثقافة معقمة تحتوي على 25 ملليلتر من محلول معقمة كلوريد الصوديوم 3٪، و 10 إلى 15 حبات زجاجية من 2.5 ملليمتر. استخدام 20 ملليلتر محلول ملحي معقم لغسل هاون في أنبوب لاسترداد أكبر قدر ممكن من macerate.
لفصل الكائنات الدقيقة من مقصورات الشعاب المرجانية المختلفة، والحفاظ على القارورة تحت الانفعالات المستمرة في 150 مرة ز لمدة 16 ساعة في درجة حرارة المياه من موقع أخذ العينات. لتحديد البكتيريا، قم أولاً بإجراء عمليات تخفيف متسلسل تصل إلى 10 إلى التسعة السالبة في محلول ملحي معقمة لعينات المرجان وما يصل إلى 10 إلى الستة السلبية لعينات المياه. الماصات التخفيف صعودا وهبوطا خمس مرات قبل تجاهل الطرف.
ثم دوامة كل واحد. دوامة العينات لمدة خمس ثوان في كل مرة قبل تنفيذ التخفيف التسلسلي المقبل. Pipette 100 ميكرولترات من كل تخفيف على أطباق بيتري التي تحتوي على 3٪ كلوريد الصوديوم lysogeny مرق أجار المتوسطة وطبقة لهم.
احتضان لوحات لمدة يوم واحد إلى ثلاثة أيام في درجة الحرارة المستهدفة، على سبيل المثال 26 درجة مئوية. تحقق من اللوحات مرة واحدة في اليوم. حدد وعزل المستعمرات تقديم morphologies النمو متميزة على لوحات جديدة باستخدام تقنية لوحة خط.
كرر هذه الخطوة عدة مرات حسب الحاجة إلى أن يكون مستعمرات نقية تنمو على لوحات. تخزين العزلات عند أربع درجات مئوية أو في الجلسرين كما هو موضح في المخطوطة. لإجراء اختبار القدرة على تدهور EE2، اختر مستعمرة واحدة من الألواح الطازجة ولقح في مليلترين من متوسطة LB المعقمة في أنبوب.
في حالة ما إذا كان مخزون الجلسرين, اتخاذ 10 ميكروليترز من الأسهم البكتيرية الجلسرين و streak على لوحات LB agar. احتضان في 24 إلى 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها أن يكون مستعمرات واحدة تنمو. وضع أنبوب يحتوي على LB المتوسطة يميل تحت التحريض المستمر في 150 مرات ز في 24 إلى 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
بعد نمو البكتيريا، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 8، 000 مرات ز لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المُندفع. لغسل مرق LB المتبقية، إضافة ملليلتر اثنين من المياه المالحة لإعادة تعليق الخلايا.
كرر الغسيل مرتين لضمان عدم وجود أي آثار لمصدر الكربون. تلقيح الخلايا المغسولة وإعادة تعليقها في الحد الأدنى بوشنيل هاس الثقافة المتوسطة التي تحتوي على EE2 كمصدر الكربون الوحيد. تقييم النمو البكتيري بالكثافة البصرية عند 600 نانومتر ووحدات تشكيل المستعمرة على متوسط LB agar بعد 16 إلى 72 ساعة من الحضانة.
لإعداد الحد الأدنى من الوسائط التي تحتوي على جزء قابل للذوبان في الماء والنفط والمياه غير قابلة للذوبان كمصدر الكربون الوحيد، إضافة 1-2٪ النفط الخام إلى 500 ملليلتر من الماء المقطر العقيمة في قارورة مرشح يحتوي على صمام على الجزء السفلي. إبقاء القارورة تحت الانفعالات المستمرة في 24 إلى 28 درجة مئوية في 150 مرات ز لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، ضع القارورة على سطح مستقر وانتظر 10 إلى 20 دقيقة للسماح للكسر القابل للذوبان وغير القابل للذوبان بالاصطياح.
ثم افتح قارورة التصفية السفلية لنقل الكسر القابل للذوبان في الزيت والماء إلى قارورة معقمة جديدة توفر الكسر غير القابل للذوبان في الزيت والماء. ثم إعداد زجاجتين من بوشنيل هاس agar الحد الأدنى المتوسطة. اُنفسها
الجمع مع الكسر القابل للذوبان في الماء والنفط كمصدر الكربون الوحيد لجعل 500 ملليلتر من أجار المتوسطة. تفعل الشيء نفسه مع الكسر النفط والماء غير قابلة للذوبان ونقل ما يقرب من 25 ملليلتر من كل المتوسطة على أطباق بيتري الفردية. لعزل البكتيريا المهينة للنفط، إعادة استخدام العينات المخففة سابقا والماصات 100 ميكرولترات من كل تخفيف على أطباق بيتري التي تحتوي على متوسطة أغار وطبق لهم.
تذكر أن تبقي على الضوابط السلبية لوحات الخاص بك. احتضان الأطباق لمدة يوم إلى ثلاثة أيام في درجة الحرارة المستهدفة وتكرار إجراءات العزل كما كان سابقا. في هذا البروتوكول، تم عزل الكائنات الدقيقة من مصادر المياه المختلفة والنوبيينات المرجانية التي تقدم خصائص بي إم سي المفترضة وقادرة على تحلل فئات مختلفة من الملوثات.
وباستخدام عينات المياه التي تم جمعها في محطة لمعالجة مياه الصرف الصحي التي تم الحصول عليها من المركز التجريبي للإصحاح البيئي التابع للجامعة الاتحادية في ريو دي جانيرو، تم عزل 33 سلالة بكتيرية قادرة على تدهور 33 سلالة EE2. وبالإضافة إلى ذلك، وباستخدام تقنية اختيار البكتيريا المتدهورة للنفط، تم عزل 20 سلالة قادرة على تحلل كل من الكسر القابل للذوبان في الزيت والماء والجزئ غير القابل للذوبان. تم فحص خصائص BMC المفترضة في الكائنات الحية الدقيقة ، من بينها سلالة تقدم نشاطًا عدائيًا قويًا ضد مسببات الأمراض المرجانية Vibrio cholerae lyticus ، وتم العثور على سلالات قادرة على تحلل اليوريا ، ومنتج كاتالوز جيد ، والكائنات الدقيقة التي تقدم جينات مفيدة محتملة.
باستخدام كل من العلاج الحيوي والتطعيم BMC، كان من الممكن التنبؤ بالشعاب المرجانية من آثار التعرض للنفط. تم تلقيح كونسورتيوم PBMC ثنائي الفينيل الحيوي المعزول عن المرجان على النوبين المرجاني المعرض لزيت بنسبة 1٪." وأظهرت قدرة أفضل على الحفاظ على الكيماويات الضوئية مقارنة مع صحة المرجان مع عدم التطعيم.
لا تترك العينات في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة جدا. خلاف ذلك، قد يتغير المجتمع الميكروبي والميكروبات المرتبطة بالأمراض قد تعصف بأخرى. النفط الخام سام.
يرجى التأكد من استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة عند العمل مع هذا أو أي ملوث آخر تقرر استخدامه. وقد مهدت هذه التقنية طريقاً مبتكراً في مجال استعادة المرجان وإصلاح المحيطات البيولوجية، ويمكن أن تستخدم للتقليل إلى أدنى حد من الآثار الاقتصادية والإيكولوجية والاجتماعية الناجمة عن التغير العالمي.
