بروتوكولنا الجديد يسمح لنا في الواقع لتصور الهياكل الخلوية في 3D باستخدام التصوير المقطعي بالأشعة السينية. ونحن نفعل ذلك عن طريق تلطيخ الأنسجة مع ايوسين وبهذه الطريقة جعل السيتوبلازم مرئية. وإلى جانب التطبيقات الطبية والبحوث، نعتقد أيضا أن طريقتنا يمكن تطبيقها في علم الأحياء مثل، على سبيل المثال، علم الحيوان أو البيولوجيا التنموية.
هذه التقنية هي واضحة نسبيا، سريع جدا، ومناسبة أيضا لعينات الأنسجة أكبر. نعتقد أن نهجنا جنبا إلى جنب مع التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية يمكن دمجها في سير العمل السريري ومن ثم مساعدة علماء الأمراض في اتخاذ قرارات أفضل. ابدأ من خلال تثبيت عينات الأنسجة الرخوة.
ملء أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مع حل التثبيت التي تحتوي على 9.5 ملليلتر من 4٪ الفورمالديهايد و 0.5 ملليلتر من حمض الخليك الجليدية. إضافة عينة الأنسجة الرخوة إلى أنبوب الطرد المركزي وتبريده لمدة 24 إلى 72 ساعة. بعد التبريد غسل عينة الأنسجة اللينة مع حل DPBS لمدة ساعة واحدة.
ثم وصمة العينة عن طريق وضعها في مليلترين من محلول إيوسين Y تلطيخ واحتضانه على لوحة اهتزاز أفقية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي بعناية أخذ عينة الأنسجة الرخوة من الحاوية عينة وإزالة عامل تلطيخ الزائدة مع ورقة الأنسجة السليلوز. وضعه في حاوية مخروطية فوق مرحلة بخار الإيثانول للتخزين واستخدام مزيد من.
إعداد حامل عينة مناسب لتركيب عينة الأنسجة الرخوة وفقًا لاتجاهات المخطوطة وضمان ملائمة ضيقة لمنع العينة من التحرك أثناء قياسات الأشعة السينية. مرة واحدة قد تصلب لاصق وحامل العينة على استعداد للاستخدام، ونقل الكلى الماوس في أنبوب جهاز الطرد المركزي سليمة الذي يحمل بضع قطرات من 70٪ الإيثانول في الجزء السفلي. ضع العينة المثبتة في الماسح الضوئي المقطعي المحوسب بالأشعة السينية.
بعد محاذاة العينة بعناية، اختر معلمات الحصول على أفضل جودة للصورة. بالنسبة لبيانات التصوير المقطعي المجهري المعروضة، احصل على المسح الضوئي عند ذروة جهد 50 كيلوفولت وتيار 3.5 واط باستخدام إسقاطات 1601 موزعة بالتساوي على 360 درجة. ثم استخدم بيانات التصوير المقطعي الجزئي من الفحص العام لتحديد المنطقة ذات الأهمية للمسح المقطعي المحوسب عالي الدقة.
إعداد كميات من الفائدة من عينة الأنسجة الرخوة عن طريق قطعها إلى قطع صغيرة جدا من طول حافة 0.5 ملليمتر تقريبا باستخدام مشرط والمجهر ستيريو. إذا كان استخدام الكلى الماوس، وقطع إلى نصفين على طول أطول محور. خذ نصفه واعد مناطق تشريحية مختلفة مثل القشرة الكلوية والنخاع الكلوي.
نقل القطع الصغيرة إلى طبق بيتري جديد للجفاف. قم بتجفيف العينات باستخدام سلسلة من حلول الإيثانول وفقًا لتوجيهات المخطوطات ، وأداء كل خطوة جفاف لمدة ساعة واحدة. نقل العينات المجففة في كبسولة microporous وإغلاقه.
إبقاء العينات في اتصال مع 100٪ الإيثانول في جميع الأوقات. ثم النقطة الحرجة تجف قطع الأنسجة الصغيرة. مرة واحدة يتم إعداد عينات الأنسجة، الاحتفاظ بها في طبق بيتري جديدة مخزنة في مجفف قبل استخدامها.
جبل قطع الأنسجة إلى حامل عينة مناسبة ضمان تناسب ضيق. لماوس superglue الكلى القطع إلى حامل عينة باستخدام مجهر ستيريو. بعد المحاذاة الدقيقة للعينة، اختر معلمات الحصول على أفضل جودة تصوير.
بالنسبة لبيانات التصوير المقطعي النانوي، احصل على إسقاطات عند ذروة الجهد البالغ 60 كيلوفولت مع 1599 إسقاط موزعة بالتساوي على 360 درجة وحجم voxel حوالي 400 نانومتر. وقد استخدم هذا البروتوكول للتصور 3D من هياكل الأنسجة المجهرية من الكلى الماوس. وقد سمحت قياسات التصوير المقطعي الصغرى المنخفضة الدقة بإجراء نظرة عامة على الجهاز بأكمله وساعدت في تحديد أحجام الاهتمام بالنسبة للقياسات العالية الدقة.
تم استخدام نفس الكلى الماوس للحصول على بيانات التصوير المقطعي الجزئي عالية الدقة. يتم تحقيق رؤية أكثر تفصيلا للهياكل التشريحية مثل القشرة، والنخاع الخارجي، والنخاع الداخلي من بين أمور أخرى. ويظهر حجم تقديم الفائدة منطقة النخاع وقسم افتراضي من خلال السفينة.
تم استخدام نانو CT للحصول على عرض مفصل لعينة الكلى على المستوى الخلوي. تم استخدام قطعة صغيرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من كلية الماوس بأكملها لتصوير الأطراف الصاعدة السميكة لحلقة Henle بحجم voxel حوالي 400 نانومتر. وقد أجريت دراسة مقارنة للتأكد من أن نانو CT متوافق تماما مع علم الأنسجة.
وأكد نهج التصوير المتعدد الوسائط النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام كلتا الطريقتين. خلال خطوة الحضانة من المهم أن العينة محاطة بالكامل بحل البقع. أيضا عند إجراء التصوير بالأشعة السينية CT، فإن الحقيقة الأكثر أهمية هي ضمان استقرار العينة أثناء الحصول على البيانات.
يمكن تحليل عينات الأنسجة الرخوة التي تم تحليلها باستخدام بروتوكولنا باستخدام تقنية الأنسجة القياسية مثل الهما أوكسيلين المضاد. بروتوكول تلطيخ لدينا سوف تسهم بشكل كبير في النهوض 3D الأشعة السينية الأنسجة. وسوف تستفيد البحوث الطبية بشكل خاص من هذه التقنية غير تدميرية 3D التصوير.
