Yeni protokolümüz aslında x-ışını bilgisayarlı tomografi kullanarak hücresel yapıları 3Boyutlu olarak görselleştirmemizi sağlıyor. Ve bunu eozinle dokuyu boyatarak yapıyoruz ve bu şekilde sitoplazmayı görünür hale getirdik. Tıbbi uygulamalar ve araştırmaların yanı sıra, yöntemimizin zooloji araştırmaları veya gelişim biyolojisi gibi biyolojide de uygulanabileceğini düşünüyoruz.
Teknik nispeten basit, çok hızlı ve aynı zamanda büyük doku örnekleri için uygundur. X-Ray mikro bilgisayarlı tomografi ile birlikte yaklaşımımızın klinik iş akışına entegre edilebildiğini ve daha sonra patologların daha iyi kararlar alabına yardımcı olabileceğini düşünüyoruz. Yumuşak doku örneklerini sabitleyerek başlayın.
50 mililitrelik bir santrifüj tüpünü %4 formaldehit ve 0,5 mililitre buzul asetik asit 9,5 mililitre içeren fiksatif bir solüsyonla doldurun. Santrifüj tüpüne yumuşak doku örneğini ekleyin ve 24 ila 72 saat buzdolabında bekletin. Soğutma dan sonra yumuşak doku örneğini DPBS solüsyonu ile bir saat yıkayın.
Daha sonra eosin Y boyama çözeltisi iki mililitre yerleştirerek örnek leke ve 24 saat boyunca yatay bir sallayarak plaka üzerinde kuluçka. Ertesi gün dikkatle örnek konteyner yumuşak doku örneği almak ve selüloz doku kağıt ile aşırı boyama maddesi kaldırın. Depolama ve daha fazla kullanım için bir etanol buharı fazı üzerinde konik bir kapta yerleştirin.
Yumuşak doku örneğini el yazması talimatlara göre monte etmek için uygun bir numune tutucu hazırlayın ve x-Ray BT ölçümleri sırasında numunenin hareket etmesini önlemek için sıkı bir uyum sağlayın. Yapıştırıcı sertleştikten ve numune tutucu kullanıma hazır olduğunda fare böbreğini alt kısmında %70 etanol içeren sağlam santrifüj tüpüne aktarın. Monte edilen örneği x-Ray CT tarayıcısına yerleştirin.
Örneği dikkatlice hizaladıktan sonra, en iyi görüntü kalitesi için edinme parametrelerini seçin. Sunulan mikro CT verileri için, 360 derecenin üzerinde eşit olarak dağıtılan 1601 projeksiyonu kullanarak 50 kilovolt luk bir maksimum voltajve 3,5 watt'lık bir akımla taramaya sahip olabilirsiniz. Daha sonra yüksek çözünürlüklü CT taraması için ilgi bölgesini seçmek için genel bakış taramasından mikro CT verilerini kullanın.
Neşter ve stereo mikroskop kullanarak yaklaşık 0,5 milimetre lik kenar uzunluğunda çok küçük parçalara ayırarak yumuşak doku örneğinin ilgisini hazırlayın. Bir fare böbreği kullanıyorsanız, en uzun eksen boyunca iki yarıya bölün. Bir buçuk alın ve bir renal korteks ve renal medulla gibi farklı anatomik bölgeler hazırlamak.
Dehidratasyon için yeni bir Petri kabına küçük parçalar aktarın. El yazması talimatlara göre bir dizi etanol çözeltisi kullanarak numuneleri susuz bırakın, her dehidratasyon adımını bir saat boyunca gerçekleştirin. Kurutulmuş numuneleri mikro gözenekli kapsüle aktarın ve kapatın.
Örnekleri her zaman %100 etanolle temas halinde tutun. Sonra kritik nokta küçük doku parçaları kuru. Doku örnekleri hazırlandıktan sonra, daha fazla kullanmadan önce bir kurutucuda saklanan yeni bir Petri kabında saklayın.
Doku parçalarını uygun bir numune tutucuya monte edin ve sıkı bir uyum sağlanın. Bir fare böbrek için bir stereo mikroskop kullanarak bir örnek tutucu için parçaları superglue. Numunenin dikkatli bir şekilde hizalanmasından sonra, en iyi görüntüleme kalitesi için edinme parametrelerini seçin.
Sunulan nano-CT verileri için, 1599 projeksiyonları eşit 360 derece ve yaklaşık 400 nanometre bir voxel boyutu dağıtılan 60 kilovolt bir pik voltaj projeksiyonlar elde. Bu protokol fare böbreğinin mikroskobik doku yapılarının 3 boyutlu görüntülenmesi için kullanılmıştır. Düşük çözünürlüklü mikro BT ölçümleri tüm organın genel görünümüne olanak sağladı ve yüksek çözünürlüklü ölçümler için ilgi hacimlerinin belirlenmesine yardımcı oldu.
Aynı fare böbrek yüksek çözünürlüklü mikro CT veri elde etmek için kullanılmıştır. Diğerleri arasında korteks, dış medulla ve iç medulla gibi anatomik yapıların daha ayrıntılı bir görünümü elde edilir. Bir ilgi hacmi medulla bölge ve gemi ile sanal bir bölüm gösterir.
Nano-CT hücresel düzeyde böbrek örneğinin ayrıntılı bir görünüm elde etmek için kullanılmıştır. Tüm fare böbreği elde edilen doku küçük bir parça yaklaşık 400 nanometre bir voxel boyutu ile Henle döngü kalın yükselen uzuvları görüntü için kullanılmıştır. Nano-BT'nin histopatoloji ile tam uyumlu olmasını sağlamak için karşılaştırmalı bir çalışma yapıldı.
Multimodal görüntüleme yaklaşımı her iki yöntemle elde edilen sonuçları doğruladı. Kuluçka adımı sırasında numunenin tamamen boyama çözeltisi ile çevrili olması çok önemlidir. Ayrıca CT x-ray görüntüleme yaparken, en önemli gerçek veri toplama sırasında örnek istikrar sağlamaktır.
Protokolümüzle analiz edilen yumuşak doku örnekleri hematoksilinle karşı boyama gibi standart histolojik teknik kullanılarak daha da analiz edilebilir. Boyama protokolümüz 3Boyutlu x-ışını histolojisine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır. Tıbbi araştırmalar özellikle bu zararsız 3D görüntüleme tekniğinden yararlanacaktır.
