이 프로토콜을 통해 연구자들은 하이드로겔의 강성과 식민지의 기하학을 완벽하게 제어하여 하이드로겔에 줄기 세포 식민지를 배양할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 조직 배양 플라스틱보다 생리적 환경을 더 잘 모방하는 조건에서 줄기 세포 식민지를 배양할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜을 처음 수행할 때는 모든 물질을 몇 개 더 생성하고 각 단계에서 문제를 해결하고 최적화할 수 있도록 형광 리간드를 사용해야 합니다.
이 기술은 다양한 재료의 정확한 위치를 포함하는 여러 단계를 포함한다. 이 프로토콜이 수행된 것을 본 후에는 이 프로토콜에 대한 서면 지침을 이해하는 것이 훨씬 쉽습니다. 이 절차를 시작하려면 PDMS 베이스를 PDMS 경화제와 10 대 1 비율로 혼합하고 완전히 혼합하십시오.
이 혼합물을 건조기에서 30~60분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 탈가스를 제거합니다. 준비된 웨이퍼의 표면에 PDMS 혼합물을 천천히 고르게 붓습니다. 작업 표면의 접시를 탭하여 웨이퍼 표면에서 기포를 방출합니다.
PDMS를 섭씨 70도에서 2시간 동안 굽고 실온으로 식힙니다. 그런 다음 PDMS를 약 10mm 사각형으로 잘라내고 각각 단일 실험 조건에 대한 특징을 포함합니다. 이를 프로토콜의 나머지 부분에 대한 우표라고 합니다.
그 후 PDMS 베이스를 PDMS 경화제와 8대 1의 비율로 혼합하고 철저히 섞는다. 30~60분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 혼합물을 건조기에서 탈가스로 드게합니다. 다음으로 PDMS를 100mm 의 깨끗한 접시에 천천히 고르게 붓습니다.
작업 표면의 접시를 탭하여 기포를 방출합니다. PDMS를 섭씨 70도에서 2시간 동안 굽고 실온으로 식힙니다. 이전에 생성된 각 스탬프에 대해 15mm 의 PDMS 사각형을 잘라냅니다.
이를 프로토콜의 나머지 부분에 대해 플랫 슬래브로 지칭됩니다. 생성된 각 스탬프를 PDMS의 평평한 슬래브에 반전하여 스탠드의 피쳐가 PDMS의 평평한 슬래브와 접촉하도록 합니다. 스탬프 상단을 집게로 부드럽게 눌러 접촉도 보장합니다.
다음으로, 각 스탬프와 슬래브 쌍의 상단 인터페이스에 UV 치료 가능한 폴리머의 작은 방울을 놓습니다. 중합체는 중력에 의해 지원 표면 장력에 의해 둘 사이에 사악할 것입니다. 스탬프 및 슬래브 인터페이스의 가장자리에 UV 치료 가능한 폴리머의 작은 방울을 놓습니다.
이렇게 하면 리간드 솔루션을 보유하는 테두리가 만들어집니다. 그런 다음 조심스럽게 스탬프를 놓고 쌍을 UV 살균 상자에 넣습니다. 멸균 STR 전원 설정을 사용하고 10 분 동안 노출하십시오.
그 후, UV 살균 상자에서 쌍을 제거하고 UV 치료 가능한 폴리머에서 형성 된 평평한 슬래브와 스텐실을 누르면서 부드럽게 스탬프를 제거하기 위해 두 쌍의 집게를 사용합니다. 집게를 사용하여 스텐실을 조심스럽게 제거하고 PDMS의 평평한 슬래브와 접촉하는 표면이 위를 향하고 있도록 반전하십시오. 반전된 스텐실을 UV 멸균 상자에 다시 넣습니다.
멸균 STR 전원 설정을 사용하고 3 분 동안 노출하십시오. 집게를 사용하여 각 스텐실 플랫 사이드를 산세척 커버슬립에 조심스럽게 배치하여 커버 슬립에 특징이 중심이 되도록 합니다. 각 스텐실 위에 실험실 필름의 작은 조각을 배치합니다.
스텐실과 커버슬립 사이의 강한 접촉을 만들기 위해 스텐실을 단단히 고르게 누릅니다. 커버 슬립을 스텐실로 접시에 놓습니다. 이 접시를 플라즈마 클리너에 넣고 고출력 플라즈마를 30초 간 적용합니다.
그런 다음 리간드 용액을 각 스텐실의 표면에 파이펫합니다. 10~10mm 평방 스탬프로 만든 스텐실의 경우 스텐실당 100마이크로리터를 적용하십시오. 그 후, 실험실 필름에 커버 슬립이 들어있는 접시를 감싸고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오.
먼저 집게를 사용하여 커버슬립을 스텐실로 씻어 멸균 PBS가 함유된 접시에 잠깐 담급한다. 커버슬립을 스텐실로 침수하여 PBS의 두 번째 단계로 잠급하여 다시 씻어낸다. 커버슬립을 깨지 않도록 주의하여 커버슬립 표면에서 스텐실을 제거합니다.
다음으로, PBS 세척에서 소금을 제거하기 위해 초순수물이 함유된 접시에 커버슬립을 잠깐 담급한다. 커버슬립의 가장자리를 터치하여 섬세한 작업 닦아 여분의 물을 심지냅니다. 질소와 같은 불활성 가스 아래 덮개 미끄러짐을 건조시십시오.
이어서, 원하는 하이드로겔 탄성을 얻기 위해 폴리아크릴아미드 용액을 준비한다. 패턴이 있는 각 커버슬립에 대해, 위에 스페이서가 놓인 글루타랄데히드 활성화 된 바닥 커버 입술을 준비합니다. 각 글루타랄데히드 활성화 커버슬립의 중심에 폴리 아크릴아미드 용액의 75~150마이크로리터 사이의 파이펫.
포셉을 사용하여 패턴 리간드가 폴리아크릴아미드 용액을 향하도록 폴리아크라이하이드 활성화 커버슬립과 폴리아크라일아미드를 장착한 스페이서에 슬립을 덮기 위해 패턴을 배치합니다. 각 폴리아크릴아미드 샌드위치를 15밀리리터 원추형 바닥 튜브와 호환되는 실이 있는 캡 홀더에 조심스럽게 배치합니다. 15 밀리리터 원추형 바닥 튜브를 각 캡 홀더에 나사로 고정하여 폴리아크릴아미드 샌드위치를 제자리에 고정시하십시오.
원심분리기에서 폴리아크릴아미드 샌드위치를 스윙 버킷에 200회 G로 200회 G로 실온에서 10분간 샌드위치로 바릅니다. 원심분리기에서 튜브를 제거하고 튜브 랙에 배치하여 전체 중합을 보장하기 위해 50분 동안 방향을 유지합니다. 그런 다음 튜브에서 샌드위치를 제거하고 PBS에 담급니다.
접시를 실험실 필름으로 감싸고 실온에서 3시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양합니다. 그 후 메스와 집게를 사용하여 PBS에 잠긴 채로 폴리아크라일아미드 샌드위치에서 슬립과 스페이서를 덮는 패턴을 조심스럽게 제거합니다. 각 커버슬립을 패턴 폴리아크라일아미드를 캡 홀더에 넣습니다.
커버 슬립 의 상단과 스페이서가 위치한 폴리 아크릴 아미드 주위에 개스킷의 장소. 톱질된 15mm 원추형 바닥 튜브를 캡 홀더에 넣고 바닥에 패턴폴리아크라일라미드를 잘 형성합니다. 이 어셈블리는 쉽게 취급할 수 있는 표준 12 웰 플레이트의 우물에 적합합니다.
이 기술을 수행할 때, 유리 커버 슬립의 표면에 원하는 패턴이 생성되고 중합 중에 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 성공적으로 전달되도록 형광 리간드를 사용한다. 이 방법의 성공의 궁극적 인 척도는 패턴 하이드로겔에 원하는 형상에서 hESC를 배양 할 수있는 능력입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양하면 hESC는 일반적으로 Y27632가 미디어에서 완전히 제거되면 패턴 형상을 48~72시간 으로 완료합니다.
폴리아크릴아미드 하이드로겔의 밀폐된 기하학에서 hESC 콜로니를 배양하면 견인력 현미경을 사용하여 세포에서 생성된 견인력의 측정이 허용됩니다. 이러한 측정은 하이드로겔에 형광 마이크로스피어를 포함하고 hESC를 시드하기 전과 후에 이러한 구슬의 위치를 이미징하여 이루어집니다. 비드 위치의 이미지는 비드 변위 맵을 생성하는 데 사용할 수 있으며, 이 변위는 기본 견인력 응력을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
hESC의 원형 식민지에서 가장 큰 견인 응력은 식민지의 주변 가장자리 근처에서 발견되며 식민지 의 중심은 균일하게 낮은 견인 응력을 표시합니다. 견인력의 관찰되지 않은 균일분포에도 불구하고, hESC는 유지보수 조건에서 패턴원으로 배양하고, 흉부 마커 10월 3/4및 세포 접착 분자 E-cadherin의 균일한 표현을 표시한다. 이 기술은 연구원이 인간 배아 줄기 세포를 사용하여 인간 배아를 더 잘 모델링하는 것을 가능하게 할 것입니다 궁극적으로 인간이 어떻게 발전하는지에 중요한 통찰력으로 이끌어 냅니다.
이 절차는 연구원이 소프트 하이드로겔에 정의된 형상에서 세포를 배양하는 것을 목표로하는 모든 응용 분야에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 절차는 대부분의 생화학산과 호환되므로 연구자들은 조직 기하학과 세포 생성 힘과 같은 것이 단백질 발현 및 세포 신호에 미치는 영향에 대한 질문에 대답할 수 있습니다. 많은 연구원은 지금 초기 인간 발달을 모형하기 위하여 인간적인 배아 줄기 세포를 이용하고 있습니다.
이 기술은 연구원이 더 나은 생리환경을 모방하는 조건에서 이 중요한 질문에 대답할 수 있게 해 줄 것입니다.
