このプロトコルは、ヒドロゲルの剛性とコロニーの幾何学の両方を完全に制御して、ヒドロゲル上の幹細胞コロニーを培養することを可能にする。この技術の主な利点は、研究者が組織培養プラスチックよりも生理的環境をよりよく模倣する条件で幹細胞コロニーを培養することができるということです。このプロトコルを初めて実行する場合は、各ステップでトラブルシューティングと最適化ができるように、すべての材料を数個生成し、蛍光リガンドを使用してください。
この手法には、さまざまな材料の正確な位置決めを含む複数のステップが含まれます。このプロトコルの説明書を理解する方が、このプロトコルを見た方が簡単です。この手順を開始するには、PDMSベースとPDMS硬化剤を10対1の重量比で混合し、十分に混合します。
この混合物をデシケーターで30〜60分間、またはすべての気泡が除去されるまで脱気する。調製したウェハの表面上にPDMS混合物をゆっくりと均等に注ぎます。作業面の皿をタップして、ウエハの表面から気泡を放出します。
PDMSを摂氏70度で2時間焼き、室温まで冷まします。その後、PDMSを約10~10ミリメートルの正方形に切断し、それぞれが単一の実験条件の特徴を含みます。これらは、プロトコルの残りの部分のスタンプと呼ばれます。
この後、PDMSベースをPDMS硬化剤と混ぜ合わせ、8対1の重量比で、十分に混合します。30〜60分間、またはすべての気泡が除去されるまで、デシケータ中の混合物を脱気する。次に、ゆっくりと均等にきれいな100ミリメートル皿にPDMSを注ぎます。
作業面の皿をタップして、気泡を放出します。PDMSを摂氏70度で2時間焼き、室温まで冷まします。以前に生成されたスタンプごとに、PDMSの15%15ミリメートル平方をカットします。
これらは、プロトコルの残りの部分ではフラットスラブと呼ばれます。PDMS のフラットスラブに接触するスタンドの機能を PDMS のフラット なスラブに、生成された各スタンプを反転します。スタンプの上部を鉗子で軽く押して、接触を確実にします。
次に、各スタンプとスラブペアの上部の界面に、UV硬化性ポリマーの小さな滴を置きます。ポリマーは重力によって助けとなる表面張力によって2つの間に邪悪になる。スタンプとスラブの界面のエッジの周りに、UV硬化性ポリマーの小さなドロップを配置します。
これにより、リガンド溶液を保持する境界が作成されます。その後、慎重にスタンプを置き、UV滅菌ボックスにペアを平手打ち。滅菌STR電源設定を使用し、10分間公開します。
この後、UV滅菌ボックスからペアを取り出し、2組の鉗子を使用して、UV硬化性ポリマーから形成された平らなスラブとステンシルを押さえながらスタンプをそっと取り除きます。鉗子を使用して、慎重にステンシルを取り外し、PDMSの平らなスラブに接触している表面が上向きになるように反転させます。反転したステンシルを UV 滅菌ボックスに戻します。
滅菌STR電源設定を使用し、3分間公開します。鉗子を使用して、各ステンシルを平らに平らにして酸洗浄カバースリップに慎重に置き、特徴がカバースリップの中心であることを確認します。各ステンシルの上に小さな実験室のフィルムを置きます。
ステンシルをしっかりと押し下げて、ステンシルとカバースリップの間に強い接触を作り出します。カバースリップを皿にステンシルで入れます。この皿をプラズマクリーナーに入れ、30秒間高出力プラズマを塗布します。
次いで、リガンド溶液を各ステンシルの表面にピペットする。10~10ミリメートルの平方フィートから作られたステンシルの場合は、1枚あたり100マイクロリットルを適用します。この後、カバースリップを含む皿を実験室フィルムに包み、一晩摂氏4度でインキュベートします。
まず、鉗子を使用して、滅菌PBSを含む皿に簡単に水没させることで、カバースリップをステンシルで洗います。カバースリップをステンシルに沈め、PBSの第2段階に浸し、再び洗浄します。カバースリップを壊さないために注意してカバースリップの表面からステンシルを取り外します。
次に、超純水を含む皿にカバースリップを簡単に沈め、PBSの洗剤から塩を取り除きます。カバースリップの端を触って繊細な作業に拭き取り、余分な水を吸い取ります。カバースリップを窒素などの不活性ガスで乾燥させます。
次いで、ポリアクリルアミド溶液を調製し、所望のヒドロゲル弾性を得る。パターン化されたカバースリップごとに、グルタルアルデヒド活性化ボトムカバーリップを上に置いたスペーサーで準備します。各グルタルアルデヒド活性化カバースリップの中心にポリアクリルアミド溶液の75と150マイクロリットル間のピペット。
鉗子を使用して、パターン化されたリガンドがポリアクリルアミド溶液に面するようにポリアクリルアミドとスペーサーで各グルタルアルデヒド活性化カバースリップにスリップをカバーするパターンを置きます。慎重に15ミリリットルの円錐状の底管と互換性のあるスレッドを持つキャップホルダーに各ポリアクリルアミドサンドイッチを置きます。15 ミリリットルの円錐状の底管を各キャップ ホルダーにねじ込み、ポリアクリルアミド サンドイッチを所定の位置に保持します。
管内のポリアクリルアミドサンドイッチに対する遠心分離機を、室温で10分間Gの200倍のGでスイングバケット内のチューブにサンドイッチする。遠心分離機からチューブを取り出し、チューブラックに入れて、さらに50分間配向を維持し、完全な重合を確実にします。その後、チューブからサンドイッチを取り出し、PBSに浸します。
皿を実験室のフィルムで包み、室温で3時間または一晩摂氏4度でインキュベートします。この後、メスと鉗子を使用して、PBSに沈んだまま、ポリアクリルアミドサンドイッチからスリップとスペーサーをカバーするパターンを慎重に取り除きます。パターン化されたポリアクリルアミドを含む各カバースリップをキャップホルダーに入れる。
カバースリップの上とスペーサーが置かれたポリアクリルアミドの周りにガスケットの場所。鋸で切った15ミリメートルの円錐形の底管をキャップホルダーにねじ込み、下部にパターン化されたポリアクリルアミドを付けて井戸を形成します。これらのアセンブリは容易な処理のための標準的な12の井戸の版の井戸に合う。
この技術を行う場合、蛍光リガンドを使用して、ガラスカバースリップの表面に所望のパターンが作成され、重合時にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面に正常に転化することを確認します。この方法の成功の究極の尺度は、パターン化されたヒドロゲル上の所望の幾何学でhESCを培養する能力である。テキストプロトコルで概説されているように培養すると、HESCは通常、Y27632がメディアから完全に取り除かれると、パターン化されたジオメトリを48〜72時間完了するために増殖します。
ポリアクリルアミドヒドロゲル上の閉じ込められた幾何学でhESCコロニーを培養することは牽引力顕微鏡を使用して細胞発生の牽引力の測定を可能にする。これらの測定は、蛍光微小球をヒドロゲルに埋め込み、hESCを播種する前後にこれらのビーズの位置をイメージングすることによって行われます。ビード位置のイメージを使用して、ビード変位のマップを生成し、その後、基礎となるトラクション応力の計算に使用できます。
hESCの円形コロニーでは、最大の牽引応力はコロニーの周辺端付近に見られ、コロニーの中心は一様に低い牽引応力を示す。観察されたトラクションストレスの不均一な分布にもかかわらず、維持条件でパターン化された円として培養されたhESCは、多能性マーカー10月3/4および細胞接着分子E-カドヘリンの均一な発現を示す。この技術により、研究者はヒト胚性幹細胞を使用してヒト胚をより良くモデル化し、最終的にはヒトがどのように発達するかについての重要な洞察につながる。
この手順は、研究者が柔らかいヒドロゲル上の定義された幾何学中の細胞を培養することを目指すあらゆる用途に適応することができる。この手順は、ほとんどの生化学的酸と互換性があり、研究者は、組織の幾何学や細胞生成力などのものがタンパク質発現および細胞シグナル伝達にどのような影響を与えるかについての質問に答えることを可能にする。多くの研究者は現在、初期のヒトの発達をモデル化するためにヒト胚性幹細胞を使用しています。
この技術は、研究者が生理学的環境をよりよく模倣する条件でこれらの重要な質問に答えることを可能にする。
