Ce protocole permet aux chercheurs de culture des colonies de cellules souches sur les hydrogels avec un contrôle total à la fois sur la rigidité de l’hydrogel et la géométrie des colonies. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs de culture des colonies de cellules souches dans des conditions qui imitent mieux l’environnement physiologique que la culture tissulaire plastique. Lors de l’exécution de ce protocole pour la première fois, assurez-vous de générer quelques extras de chaque matériau et d’utiliser un ligand fluorescent afin que vous puissiez dépanner et optimiser à chaque étape.
Cette technique implique plusieurs étapes qui impliquent le positionnement précis de divers matériaux. Il est beaucoup plus facile de comprendre les instructions écrites pour ce protocole une fois que vous l’avez vu effectué. Pour commencer cette procédure, mélanger la base PDMS avec l’agent curatif PDMS à un rapport de 10 pour un par poids et bien mélanger.
Dégazer ce mélange dans un dessiccateur pendant 30 à 60 minutes ou jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient enlevées. Verser lentement et uniformément le mélange PDMS sur la surface de la gaufrette préparée. Appuyez sur le plat sur la surface de travail pour libérer les bulles d’air de la surface de la gaufrette.
Cuire le PDMS à 70 degrés Celsius pendant deux heures et laisser refroidir à température ambiante. Ensuite, coupez le PDMS en environ 10 par 10 millimètres carrés, chacun contenant les caractéristiques pour une seule condition expérimentale. Ceux-ci seront appelés timbres pour le reste du protocole.
Après cela, mélanger la base PDMS avec l’agent curatif PDMS à un rapport de huit pour un par poids, et mélanger soigneusement. Dégazer le mélange dans un dessiccateur de 30 à 60 minutes ou jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient enlevées. Ensuite, versez lentement et uniformément le PDMS dans un plat propre de 100 millimètres.
Appuyez sur le plat sur la surface de travail pour libérer les bulles d’air. Cuire le PDMS à 70 degrés Celsius pendant deux heures et laisser refroidir à température ambiante. Pour chaque timbre précédemment généré, couper un carré de 15 par 15 millimètres de PDMS.
Ceux-ci seront appelés dalles plates pour le reste du protocole. Inverser chaque timbre généré sur une dalle plate de PDMS de telle sorte que les caractéristiques sur le stand pour en contact avec une dalle plate de PDMS. Appuyez doucement sur le dessus du timbre avec des forceps pour assurer un contact même.
Ensuite, placez une petite goutte de polymère curable UV à l’interface supérieure de chaque paire de timbres et de dalles. Le polymère sera méchant entre les deux par tension de surface assistée par la gravité. Placez une petite goutte de polymère uv-curable sur les bords de l’interface du timbre et de la dalle.
Cela crée une bordure qui tiendra la solution ligand. Placez ensuite soigneusement les paires de timbres et de gifles dans une boîte de stérilisation UV. Utilisez le réglage de puissance STR stérile et exposez pendant 10 minutes.
Après cela, retirez les paires de la boîte de stérilisation UV et utilisez deux paires de forceps pour enlever doucement le timbre tout en maintenant la dalle plate et le pochoir qui se sont formés à partir du polymère uv-curable. À l’aide de forceps, retirez soigneusement le pochoir et inversez-le de telle sorte que la surface qui est en contact avec la dalle plate de PDMS est orientée vers le haut. Remettre les pochoirs inversés dans la boîte de stérilisation UV.
Utilisez le réglage de puissance STR stérile et exposez pendant trois minutes. À l’aide de forceps, placer soigneusement chaque côté plat au pochoir vers le bas sur un coverslip lavé à l’acide en s’assurant que les caractéristiques sont centrées sur le glissement de couverture. Placez un petit morceau de film de laboratoire sur chaque pochoir.
Appuyez fermement et uniformément sur le pochoir pour créer un fort contact entre le pochoir et le coverslip. Placer les feuillets de couvercle avec des pochoirs dans un plat. Placez ce plat dans un nettoyant plasma et appliquez du plasma de grande puissance pendant 30 secondes.
Ensuite, pipette la solution ligand sur la surface de chaque pochoir. Pour les pochoirs fabriqués à partir de timbres carrés de 10 x 10 millimètres, appliquez 100 microlitres par pochoir. Après cela, envelopper le plat contenant les feuillets de couverture dans le film de laboratoire et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Tout d’abord, laver le coverslip avec du pochoir en utilisant des forceps pour le submerger brièvement dans un plat contenant pbs stérile. Submerger le coverslip avec du pochoir dans une deuxième étape de PBS pour le laver à nouveau. Retirer le pochoir de la surface du coverslip en prenant soin de ne pas casser le coverslip.
Ensuite, submergez brièvement le coverslip dans un plat contenant de l’eau ultrapure pour enlever les sels des lavages PBS. Touchez le bord du coverslip à une tâche délicate essuyer pour évacue l’excès d’eau. Séchez le glissement du couvercle sous un gaz inerte comme l’azote.
Ensuite, préparez une solution de polyacrylamide pour obtenir l’élasticité hydrogel désirée. Pour chaque coverslip à motifs, préparez un glutaraldehyde activé en bas couvre la lèvre avec un espaceur placé sur le dessus. Pipette entre 75 et 150 microlitres de solution de polyacrylamide au centre de chaque coverslip activé de glutaraldehyde.
À l’aide de forceps, placez un glissement à motifs pour couvrir chaque glissement de couverture activé par glutaraldehyde avec du polyacrylamide et de l’espaceur de sorte que le ligand à motifs fait face à la solution de polyacrylamide. Placez soigneusement chaque sandwich au polyacrylamide dans un support de bouchon avec des fils compatibles avec des tubes de fond coniques de 15 millilitres. Vissez un tube de fond conique de 15 millilitres dans chaque support de bouchon pour maintenir les sandwichs au polyacrylamide en place.
Centrifugeuse aux sandwichs en polyacrylamide dans les tubes dans des seaux oscilleux à 200 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez les tubes de la centrifugeuse et placez-les dans des supports à tubes pour maintenir l’orientation pendant 50 minutes supplémentaires afin d’assurer une polymérisation complète. Ensuite, retirez les sandwichs des tubes et submergez-les dans PBS.
Envelopper le plat dans un film de laboratoire et incuber à température ambiante pendant trois heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après cela, utilisez un scalpel et des forceps pour enlever soigneusement le motif pour couvrir les glissades et l’espaceur du sandwich au polyacrylamide pendant qu’il reste immergé dans PBS. Placer chaque coverslip avec du polyacrylamide à motifs dans un support de bouchon.
Place du joint sur le dessus de la glissade de couverture et autour du polyacrylamide où l’espaceur était situé. Visser un tube de fond conique scié de 15 millimètres dans le support du bouchon, formant un puits avec le polyacrylamide à motifs au fond. Ces assemblages s’insédent dans les puits d’une plaque de puits standard de 12 puits pour une manipulation facile.
Lors de l’exécution de cette technique, utilisez un ligand fluorescent pour s’assurer que le motif désiré est créé à la surface de la feuille de couverture en verre, et transféré avec succès à la surface de l’hydrogel polyacrylamide pendant la polymérisation. La mesure ultime du succès de cette méthode est la capacité de culture des hESCs dans les géométries désirées sur les hydrogels à motifs. Lorsqu’ils sont cultivés comme décrit dans le protocole de texte, les hESCs prolifèrent généralement pour compléter les géométries modelées de 48 à 72 heures une fois que le Y27632 est complètement retiré des médias.
La culture des colonies hESC à géométrie confinée sur les hydrogels polyacrylamides permet de mesurer les forces de traction générées par les cellules à l’aide de la microscopie par force de traction. Ces mesures sont effectuées en intégrant des microsphériques de fluorescence dans l’hydrogel et en imagerie des positions de ces perles avant et après l’ensemencement des HESC. Les images des positions des perles peuvent être utilisées pour générer des cartes des déplacements de perles qui peuvent ensuite être utilisées pour calculer les contraintes de traction sous-jacentes.
Dans les colonies circulaires de hESCs, les plus grandes contraintes de traction se trouvent près du bord périphérique des colonies, tandis que le centre des colonies affiche des contraintes de traction uniformément faibles. En dépit des distributions non uniformes observées des contraintes de traction, les hESCs ont cultivé comme cercles modelés dans des conditions d’entretien, affichent l’expression uniforme du marqueur de pluripotence 3/4 octobre et de la molécule d’adhérence cellulaire E-cadherin. Cette technique permettra aux chercheurs de mieux modéliser les embryons humains à l’aide de cellules souches embryonnaires humaines, ce qui permettra de mieux comprendre comment les humains se développent.
Cette procédure peut être adaptée à toute application dans laquelle un chercheur vise à la culture des cellules dans des géométries définies sur les hydrogels mous. Cette procédure est compatible avec la plupart des acides biochimiques, permettant aux chercheurs de répondre à des questions sur la façon dont des choses telles que la géométrie des tissus et les forces générées par les cellules affectent l’expression des protéines et la signalisation cellulaire. De nombreux chercheurs utilisent maintenant des cellules souches embryonnaires humaines pour modéliser le développement humain précoce.
Cette technique permettra aux chercheurs de répondre à ces questions importantes dans des conditions qui imitent mieux un environnement physiologique.
