في هذا البروتوكول نبين كيفية استخدام طريقة المعيشة الحرة ج. elegans لتوضيح الإمراضية الناجمة عن بيروكسيد الهيدروجين المنتجة عن طريق مجموعة Mitis العقدية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن ندرس الإمراضية وتفعيل استجابات الإجهاد في الدودة باستخدام مصدر بيولوجي مستدام لأنواع الأكسجين التفاعلية بدلاً من المصادر الكيميائية لتر واحد من وسائل الإعلام إضافة 30g من مسحوق تود هيويت، 2g من استخراج الخميرة و 20g من أجير إلى 2 لتر قارورة إرلين ماير.
أضف 970 مل من الماء غير المتأين إلى محتويات القارورة ووضعها في شريط ضجة. استخدام رقائق الألومنيوم لتغطية فتح. اُمَجَلّ الوسائط في القارورة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية وضغط 15 رطلًا في البوصة المربعة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك تعيين قارورة على لوحة ضجة لتهدئة مع اثارة لطيف. تحت غطاء محرك السيارة، صب وسائل الإعلام في الحجم المناسب، أطباق بيتري العقيمة. السماح لوسائل الإعلام لتجف لمدة 2 ساعة.
بعد ذلك تخزين لوحات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. قبل إعداد مجموعة تينيس المكورات العقدية، سخني لوحات THY agar في حاضنة إلى 37 درجة مئوية. بعد أن استخدام حلقة العقيمة إلى خط من السلالات المطلوبة من strepticocci على الأماكن.
ثم وضع لوحات في جرة شمعة واحتضان جرة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لمدة 18 ساعة لتوفير بيئة ميكروربيليا. في اليوم التالي، قم بإزالة الأطباق من جرة الشمعة واستخدم حلقة معقمة لالتقاط مستعمرات معزولة. تلقيح 15 مل أنابيب مخروطية معقم تحتوي على 2 مل من مرق THY.
أغلق القبعات بإحكام وحضن الأنابيب عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة. لوحات THY ما قبل الدافئة في حاضنة إلى 37 درجة مئوية إضافة 50 ميكرولترات من الحل تحتوي على 1000 وحدة من catalase على لوحة THY. استخدم جهاز توزيع معقمة لنشر محلول كاتالوز والسماح للألواح بالجفاف على غطاء تدفق اللامينا لمدة 30 دقيقة.
لزرع الأطباق مع سلالات المكورات العقدية ، استخدم ماصة لإضافة 80 ميكرولترات من الثقافات نمت بين عشية وضحاها إلى لوحة واستخدام موزع معقمة لنشر البكتيريا تماما عبر سطح أجار. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية في جرة شمعة بين عشية وضحاها. كتحكم، على اثنين من لوحات NGM، إضافة 80 microliters من الثقافات نمت بين عشية وضحاها من E.coli OP-50 للبذر.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بإزالة الأطباق من جرة الشمعة واسمح للوحات باردة لدرجة حرارة الغرفة. باستخدام قطف دودة معقمة، نقل 30 يرقات L4 من لوحات التغذية NGM إلى المكورات العقدية بذر THY.
احتضان لوحات في 25 درجة مئوية. تحت مجهر تشريح، عد عدد من اليرقات L4 الحية والميتة على كل لوحة في عدة نقاط زمنية. استخدام دودة معقم اختيار لحث بلطف الديدان وتحديد ما إذا كانت ميتة أو على قيد الحياة.
في البداية ، وتسجيل الديدان الميتة أو يعيش كل 30 دقيقة. عندما الديدان تبدأ بسرعة في الموت، يسجل لهم في فترات 15 دقيقة. سوف يستغرق الفحص من 5 إلى 6 ساعات لإكمال.
بعد ذلك، كرر التجربة مرتين اُلّاً. لإعداد لوحة agarose، عصا labtape بالطول على طول اثنين من الشرائح الزجاجية. وهذا سيحدد سمك منصات agarose.
ضع شريحة زجاجية نظيفة بين الشرائح اُقرِت. تذوب agarose في المياه الأيونية لجعل 2 حجم الوزن في المئة والحرارة الحل في الميكروويف. استخدام ماصة لوضع 100 ميكرولترات من agarose المنصهر على وسط الشريحة النظيفة.
ضع على الفور شريحة زجاجية نظيفة أخرى على قمة agarose المنصهر واضغط بلطف لأسفل لجعل لوحة. السماح لأكروز لترسيخ ثم إزالة الشريحة العليا. لوحة agarose جاهزة للاستخدام.
قبل الساخنة THY لوحات إلى 37 درجة مئوية. بذور لوحات مع سلالات المكورات العقدية كما فعلت سابقا في فحوصات البقاء على قيد الحياة. بذور 3 لوحات NGM مع E-القولونية OP-50 كتحكم واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، تبرد لوحات إلى درجة حرارة الغرفة. استخدام M9W العازلة لغسل يرقات L4 من NGM أو NGM RNAi لوحات التغذية في أنابيب مخروطية 15 مل. تدور الأنابيب في 450 مرات ز، لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي.
decant المابير وإضافة 10 مل من M9W إلى كل أنبوب. كرر خطوة الطرد المركزي ثلاث مرات أخرى. إعادة تعليق الديدان في 250 ميكرولترات من M9W ووضع ثلاث قطرات ميكرولتر 5 من تعليق دودة على غطاء طبق بيتري نظيفة.
تحت مجهر تشريح، تقدير عدد الديدان لكل ميكرولتر. باستخدام ماصة، إضافة ما يقرب من 100 يرقات L4 إلى كل THY العقديات المصنفة وNGM E.coli بذر لوحات. استخدام ثلاثة لوحات لكل سلالة من البكتيريا.
احتضان لوحات لمدة 2 إلى 3 ساعات في 25 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة. غسلها مع M9W وجمع الديدان في أنابيب مخروطية 15ml.
غسل الديدان ثلاث مرات كما فعلت سابقا في خطوة الطرد المركزي. إزالة معظم M9W عن طريق الطموح. وإضافة 500 ميكرولترات من M9W تحتوي على 2 ميليمولار الصوديوم أزيديد أو هيدروكلوريد رباعي الميسول إلى بيليه دودة للتخدير.
احتضان الأنبوب مع الكريات دودة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم، إسقاط 15 ميكرولترات من تعليق دودة على لوحة agorose أعدت. تحت مجهر الفلورسنت، تصور توطين skn-1 باستخدام مرشحات فيتزي و Dappy.
الديدان صورة في 10 مرات و 20 مرات التكبير. تسجيل الديدان على أساس ثلاثة مستويات من التعريب؛ توطين منخفض، حيث لا يتم ملاحظة التعريب النووي، وإضفاء الطابع المحلي المتوسط، مع SKN 1 BCGFP في الجزء الأمامي أو الخلفي من الدودة، والتعريب العالي، حيث يتم ملاحظة التعريب النووي لـ skn-1 BCGFP في جميع الخلايا المعوية. في هذه التجربة، قتل أعضاء مجموعة Mitis بسرعة الديدان، بدلا من S.mutans، S.salivarius وغير المسببة للأمراض E.coli OP-50.
عندما تم استكمال كاتالاسي إلى THY ager ، تم إلغاء قتل الديدان. لم يلاحظ موت الديدان على سلالة دلتا spxB متحولة بالمقارنة مع سلالات من نوع البرية ومجاملة. وتشير هذه البيانات إلى أن بيروكسيد الهيدروجين الذي تنتجه مجموعة ميتس يتوسط لقتل الديدان.
ولوحظ انخفاض كبير في بقاء الديدان الصدّية السكن-1 مقارنة بالدودة المعالجة لمكافحة ناقلات الأمراض. ولوحظ نمط ظاهري مماثل للقتل مع سلالة متحولة من نوع skn-1 وديدان من نوع N2 البرية. وهذا يدل على أن skn-1 تؤثر على بقاء الديدان على مجموعة Mitis.
لوحظت توطين skn-1 BCGFP في الديدان المعرضة لسلالات N-Compliment البرية وليس استجابة لسلالة دلتا spxB المتحولة من كوردونا S. بعد أن تم هدم مكونات مسار كيناز خريطة P38 ، تم ملاحظة تقليل توطين skn-1 BCGFP والديدان المعالجة بالضربة القاضية ، نسبة إلى الديدان المعالجة لمكافحة النواقل. باستخدام العقدية c.
elegans النظام ، وآثار بيروكسيد الهيدروجين على الإجهاد verticular endoplasmic ، والضرر الميتوكوندريا ، والميتوفوجي ، ويمكن مزيد من الدراسة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد الآليات التي يعمل بها بيروكسيد الهيدروجين كعامل virilescence لاستنباط الاستجابات المناعية عن طريق تعطيل العمليات الأساسية للخلية.
