وييسر هذا البروتوكول تحديد وعزل مجموعات الخلايا المرجانية الحية على مستوى وصفي لم يكن ممكنا من قبل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالوصول إلى مستوى من خصوصية الخلية التي كانت حتى الآن غير قابلة للتحقيق في الغالب. وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور شانون سايغ، وهو باحث مشارك من تدفق المصدر المشترك استئصال الخلايا في مركز السرطان الشامل سيلفستر.
لإعداد مقياس تدفق الخلايا الخلوية الحية لفرز الخلايا المرجانية، افتح قالب مشروع جديد في برنامج مقياس التدفق الخلوي وحدد الليزر المناسب للتحليل في لوحة الليزر. ثم، إنشاء الجانب مبعثر مقابل مؤامرة مبعثر إلى الأمام في المؤامرات المناسبة لإعداد استراتيجية الغات والتحليل. لتحليل تدفق الخلايا الخلوية وفرز الخلايا المرجانية الحية، تحميل عينة الخلية غير المطّوعة في غرفة العينة في مقياس الخلايا وبدء عملية القراءة.
منذ الخلايا المرجانية هشة بشكل خاص، والحفاظ على ضغط مقياس الخلايا منخفضة لمنع تحلل الخلايا. في مؤامرة مبعثر، وضبط الجهد مضاعف الصورة إلى مركز النقاط والبدء في تسجيل الأحداث. في مؤامرة التشتت الأمامية مقابل الجانب، قم بإنشاء بوابة حول الخلايا في حوالي 10 إلى العلامة الرابعة على محور مبعثر إلى الأمام.
استبدل عينة التحكم بالعينة الأولى من الخلايا الملطخة وسجل حوالي 10000 خلية قبل التوقف المؤقت. ثم بوابة الأحداث التي هي فريدة من نوعها لمجموعة عينة ملطخة. لفرز الخلايا المرجانية الحية، بعد اختيار السكان الخلية من الفائدة في برنامج تدفق مقياس الخلايا، ووضع أنبوب واحد microcentrifuge واحد يحتوي على 250 إلى 500 ميكرولترات من الحل جمع المناسبة في غرفة جمع مقياس الخلايا لكل مجموعة لفرز.
مرة واحدة وقد مرت كمية مناسبة من الوقت لطرد الحطام، والبدء في فرز السكان المطلوب لجمع في أي مكان من 10،000 إلى عدة ملايين من الخلايا. في كل مرة يتم استخدام وصمة عار جديدة ، أو الأنواع ، أو الفرز ، وفرز ما لا يقل عن 2000 خلية من الاهتمام في 500 ميكرولترات من تلطيخ المتوسطة للسماح لفحص النقاء ليتم تنفيذها على السكان من الفائدة وإعادة تحلية الخلايا فرزها للتأكد من أن يتم قراءة الأحداث داخل البوابة المستخدمة في الفرز الأولي. للدراسات المختبرية، قم بتخزين الخلايا المخروزة على الجليد حتى يتم نقلها إلى حاضنة أو بيئة معقمة.
لجلب الجزيئات غير الخلوية الأخرى التي لا تشترك في نفس الشكل أو التفاصيل مثل الخلايا المرجانية يمكن إزالتها من التحليل عن طريق إنشاء اختيار بوابة على رسمة مبعثرة إلى الأمام والجانب. يمكن استبعاد الخلايا الميتة بمقارنة إشارة DAPI من تعليق الخلايا غير الملطخة والملطخة باستخدام الرسم البياني والبوابات خارج الخلايا عالية التعبير عن DAPI. في موازاة ذلك، يمكن إزالة الخلايا التي تستضيف سيمبيوديناسيا autofluorescence عن طريق الغاء ضد الخلايا مع إشارة عالية في القناة الحمراء البعيدة.
بعد عملية الغاء المتكررة هذه، تمثل الخلايا المتبقية مجموعات الخلايا المرجانية الحية سليمة تفتقر إلى symbiodeneasia. ويمكن بعد ذلك تصنيف هذه الخلايا إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا عن طريق التلطيخ لملامح مثل نشاط أنواع الأكسجين التفاعلية و / أو محتوى الليسوسوم. من المهم أن نتذكر أن بعض الخلايا أكثر هشاشة من غيرها وتشغيل هذه العملية بعناية قدر الإمكان.
مرة واحدة وقد تم عزل خلايا محددة، ويمكن استخدامها لمجرّفات وظيفية x-vivo مثل إنشاء ثقافات الخلية وخلق ملفات تعريف النسخ.
