وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (منحة رقم 0519984 DBI) ، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة لا. 5R01GM078279)..

1) إعداد المواد النباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استخلاص العديد من Protoplasts الأنواع النباتية المختلفة والأنسجة شريطة استخدام المزيج الصحيح من جدار الخلية الانزيمات هضم 1. قبل إجراء تجربة على نطاق واسع ، والهضم الصغيرة من المواد ينصح من أجل تقييم كفاءة protoplasting من الأنسجة ، والانزيمات وغيرها ، وعلى تقدير إيجابي الخلايا في المئة لفرز الخلايا. هنا ، protoplasts المشتقة من جذور الشتلات thaliana Arabidopsis تلك الخلية من نوع خاص تستخدم تعبير الخضراء بروتين فلوري (GFP). يتم وضع علامة على endodermis وهادئة من قبل مركز SCR P : : GFP ومركز هادئة WOX5 بواسطة P : : GFP 2،3 (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الشتلات في hydroponically phytatrays (سيغما ؛ الشكل 2A) على فلتر النايلون (250 ميكرومتر شبكة ؛ NITEX) الذي يتيح للجذور النمو من خلال النمو في المتوسط ​​(0.22 ٪ W / V Murashige وسكوغ بصل متوسطة [سيغما] ، 1 ٪ ث / ت السكروز ، 0.05 ٪ W / V زارة التربية والعلم [2 -- (N - morpholino) ethanesulfonic حامض] ، ودرجة الحموضة 5.7 مع KOH). بدلا من ذلك ، يمكن زراعة النباتات على رأس مرشح النايلون (100 ميكرومتر شبكة) في وضع عمودي لوحات أجار 1 ٪ (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مرشحات معينات المذكور ليس فقط في موسم الحصاد من الجذور ، وتسهل أيضا من السهل معالجة إضافية من الشتلات ، وإذا رغبت في ذلك. مرشحات تسمح نقل الشتلات بشكل جماعي لphytatrays جديدة أو لوحات أجار تستكمل مع حافزا للاهتمام. على سبيل المثال ، مجموعة phytatray يصل استخدمت لتحليل نوع معين من الخلايا على الاستجابة للعلاج الترانسكربتي النيتروجين في الشتلات Arabidopsis 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهر ضمان أن يتم التعبير بشكل صحيح علامة الخاص فلوري (خاصة عند استخدام خيار المعالجة ، باعتبارها الخلية نوع علامات محددة قد تكون أثرت نفسها من العلاج). في هذه الحالة ، يتم فحص الشتلات تحت المجهر مضان (نيكون ؛ الشكل 1). لاحظ أن يجب أن تكون خلية نوع محدد خطوط علامة فلوري في البداية تحت المجهر مبائر لتحديد بالضبط التي تحمل أنواع الخلايا وتحديد التباين في التعبير. </li></ol> 2) إعداد الحل protoplasting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب 1.25 ٪ ث / ت سلولاز (Yakult) ، 0.3 ٪ ث / ت Macerozyme (Yakult) ، 0.4 D - M مانيتول ، 20 ملم وزارة التربية والعلم بوكل 20 ملم (من الأسهم M 1) في المياه المنزوعة المعادن وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع 1 درجة الحموضة تريس / M حمض الهيدروكلوريك 7.5. سيكون هذا الحل عكر قليلا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل الحرارة إلى 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (سيقوم بدوره حل واضح) وندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل ان يضيف 0.1 ٪ W / V BSA (ألبومين المصل البقري) ، و 10 ملي CaCl 2 ، و 5 ملي β - المركابتويثانول . </li></ol> 3) حصاد وprotoplasting من المواد النباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد جذور لهم عن طريق كشط قبالة شبكة النايلون مع مشرط وأودعت في قارورة تحتوي على حل protoplasting. عموما ، يتم استخدام 10 مل من محلول protoplasting في جذور الشتلات 1500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز القوارير بلطف (75 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قد وقتا أطول حضانة زيادة الغلة الجبلة المجردة لكنه سيضيف ايضا الى تأثير protoplasting نفسها على التعبير الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية حل الجبلة المجردة مع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر دينار بحريني (فالكون) ويقسم على حل أنابيب مخروطية 15 مل دينار بحريني (فالكون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنابيب في جهاز للطرد المركزي سوينغ دلو لمدة 10 دقيقة في ملاحظة أن هذا G. 500 سرعة الطرد المركزي ستتوقف على نوع protoplasts المستخدمة ، وهشاشتها ، ومبلغ من حطام خلية أنتجت خلال فترة العلاج الأنزيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة معظم طاف ، وresuspend protoplasts في حل المتبقية وتفتيشها المجهر (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستفادة من عدادة الكريات لتقدير عدد وكثافة protoplasts. وسوف تحدد كثافة الخلية عينة سرعة الحقن ، والأحداث التي وقعت في الدرجة الثانية ، وبالتالي فإن مجموع الوقت اللازم لفرز الخلايا في نظام مراقبة الأصول الميدانية (انظر أيضا القسم 4.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7) إما مباشرة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية أو غسل وresuspend في protoplasts في محلول الحضانة ، مثل W5 (154 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 125 ملي CaCl2 ، 5 بوكل ملم ، 5 ملم زارة التربية والعلم ، وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع كوه) أو حل دون protoplasting وأضاف الانزيمات. وخصوصا عندما تبحث في التغييرات النسخي ، فإنه من الأهمية للحد من التعرض لعينات منها للظروف التي قد تؤثر على التعبير الجيني ، مثل تغيير العازلة يتم الاحتفاظ protoplasts فيها ولذلك يوصى للحفاظ على protoplasts في حل protoplasting والمضي قدما لنظام مراقبة الأصول الميدانية في أقرب وقت ممكن. </li></ol> 4) الإسفار الفرز المنشط للخلية protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل وإعداد فارز الخلايا. هنا ، يتم استخدام FACSAria دينار بحريني (). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل تيار مع تدفق 100 متر وش ؛ فوهة م وضغط 20 رطل غمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ضبط كثافة الخلايا وسرعة حقن عينة لتجربة معينة على أساس ما إذا كانت هناك رغبة في تحقيق عائد أفضل ما يمكن تحقيقه أو سرعة أسرع. لقد قمنا بفرز بنجاح مع كثافة تصل إلى 10000000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخيار التحريض على عينة FACS لمنع الترسيب من protoplasts. إذا كان انسداد FACS هو المشكلة ، هناك ثلاث خطوات لحل المشاكل المحتملة : 1. تنفيذ backflush عينة الخط. 2. الجبلة المجردة تمييع التعليق الخاص للحد من الكثافة. 3. تنظيف الحل الجبلة المجردة من خلال تكرار خطوة الترشيح (3.3) بعد الطرد المركزي وإعادة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز لقياس التشتت إلى الأمام (FSC) ، مبعثر الجانب (SSC) و 530/30 في الانبعاثات نانومتر ونانومتر لGFP 610/20 لطيف أحمر تألق ذاتي (RSA) بعد الإثارة التي كتبها ليزر 488 نانومتر. هذه هي في الجوهر المعلمات الوحيدة المستخدمة لعزل GFP protoplasts إيجابية. هنا ، تم ضبط الجهد على النحو التالي : FSC -- 60V ، 250V محكمة أمن الدولة ، و335V 350V GFP RSA. علما أن إعدادات الجهد الأمثل سيكون مختلفا عن كل نظام مراقبة الأصول الميدانية ، وسوف تحتاج حتى إلى تعديل طوال عمر فارز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بداية من خلال إنشاء لdotplot مبعثر إلى الأمام مقابل مبعثر الجانب. تطبيق الإعدادات الجهد بحيث تتركز الأحداث تقاس في المؤامرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وخلق مؤامرة نقطة من الإشارات مضان أخضر مقابل الحمراء. تطبيق الإعدادات الجهد بحيث تقاس الأحداث تسفر عن تركز السكان قطري في المؤامرة عندما تبحث في تعليق من النوع البري الجبلة المجردة (غير GFP). وهناك تعليق الجبلة المجردة مشتقة من سطر علامة GFP إنتاج سكانية واضحة للأحداث الفلورية الخضراء لم يسبق له مثيل في البرية من نوع العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قيود التعويضات لضبط التداخل بين الأطياف وGFP RSA. سوف الإعدادات المناسبة القيد التعويض تسمح للأفضل فصل protoplasts GFP إيجابية من protoplasts غير GFP والحطام. القيود المستخدمة هنا هي على النحو التالي : RSA ، ناقص GFP 17.91 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء بوابة للتعرف على أحداث GFP إيجابية ، وينبغي أن تستخدم لمراقبة سلبية غير GFP protoplasts للمساعدة في تحديد حدود البوابة (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ قطع مبعثر إلى الأمام من أجل ترك الحطام صغيرة من التحليل. تصور أحداث GFP إيجابية في مؤامرة ضد أمن الدولة FSC للمساعدة في تحديد موضع قطع. هنا ، تم ضبط قطع في 5000. قد نلاحظ أن نظام مراقبة الأصول الميدانية سوف تحسب الحطام كأحداث الفرز وعينة لديهم مستويات عالية من الحطام في المئة لديها GFP الأحداث الإيجابية المختلفة مما كان متوقعا. هذا ليس بالضرورة مشكلة. ومع ذلك ، فإن المزيد من الحطام في العينة ، ويعد هذا النوع سوف تتخذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على التجربة وفرة من نوع من الخلايا لتحليلها ، على وضع نظام مراقبة الأصول الميدانية الدقة سواء للالعائد الأمثل أو النقاء الأمثل للخلايا التي تم فرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وإعداد مجموعة أنابيب (أنابيب microfuge 1.5 مل) مع كمية مناسبة من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي. مع هذا الإعداد ، فإن الأحداث 20000 الفرز تسفر عن إجمالي حجم ما يقرب من 100 ميكرولتر التي تم فرزها في 350 ميكرولتر من استخراج العازلة (RNeasy الصغيرة عدة ، QIAGEN). مزيج عينات بعد الانتهاء من الفرز ويمكن أن تجمع تعليق خلية في الأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين عينات أو الانتقال مباشرة إلى RNA الاستخراج. وقد تم تحليل بريفورميد ميكروأري ناجحة مع الحمض النووي الريبي المستخرج من اقل من 500 الأحداث التي تم فرزها. هنا ، استخدمنا عدة RNeasy استخراج الصغرى (QIAGEN) ، والحفاوة WT - RNA نظام التضخيم بيكو وFL - الحفاوة [كدنا] البيوتين الوحدة V2 (NuGEN). </li></ol> ممثل النتائج واحد من حوالي 1500 phytatray SCR ف مدة أسبوع واحد من العمر : حققت الشتلات GFP حوالي 60،000 protoplasts (مقاسا عدادة الكريات). وقد تم تحديد 2.6 ٪ من 65000 الأحداث FACS المجهزة GFP بأنها ايجابية وكانت مصنفة (الشكل 4B). ثماني لوحات من ف اربعة ايام من العمر حوالي 1500 WOX5 : حققت كل شتلة GFP (12000 الكل) حول protoplasts 30000000 (مقاسا عدادة الكريات). وقد تم تحديد 0.063 ٪ من 16000000 الأحداث FACS المجهزة GFP بأنها ايجابية وكانت مصنفة (4C الشكل). وعادة ما تستخدم 10000 فرز الأحداث لاستخراج الحمض النووي الريبي ، ويمكن أن تسفر 20-140 نانوغرام مجموع RNA (الشكل 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. واتخذت الخلية علامة GFP اكتب خطوط محددة في جذر Arabidopsis. الصور المجهري الإسفار مع النقيض تدخل الفرق (DIC) وتصفية GFP على مجهر 90i الكسوف (نيكون) يعمل على برنامج Metamorph (الأجهزة الجزيئية). وكانت مدينة دبي للإنترنت مضافين الصور وGFP لأغراض التصور. وتظهر علامة خطوط اللتين استخدمتا في هذه التجربة البصرية ؛أ) P SCR : : GFP وب) P WOX5 : GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. كانت تزرع النباتات ظروف النمو. الشتلات في وحدة تحكم في البيئة hydroponically phytatrays (أ) أو وضعه على لوحات أجار عموديا (ب). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. protoplasts النباتية معربا عن GFP وتم التقاط صور مع المجهري الإسفار المقابل تدخل الفرق (DIC) وتصفية GFP على مجهر 90i الكسوف (نيكون) يعمل على برنامج Metamorph (الأجهزة الجزيئية). وكانت مدينة دبي للإنترنت مضافين الصور وGFP لأغراض التصور. سهام تشير إلى وجود خلية تنفجر ، والحطام الخلوي وعلى الجبلة المجردة GFP إيجابية. المسافة بين اثنين من خطوط بيضاء على بعد 50 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. مضان تنشيط الخلايا الفرز من GFP إيجابية protoplasts Protoplasts المستمدة من نوع البرية (أ) ف SCR : : GFP (ب) أو ف WOX5 : GFP (ج) تم تحليل خطوط العلامة وفرزها مع FACSAria دينار بحريني () باستخدام بوابات المعرفة على dotplot الخضراء (530 / 30 نانومتر ؛ محور س) مقابل الحمراء (610 / 20 نانومتر ؛ ذ المحور) مضان. وتعرض 100،000 الأحداث في كل قطعة. وسلط الضوء على الأحداث التي تقع في GFP بوابة الفرز الخضراء. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. ممثل RNA الاستخراج من 10،000 الخلايا التي تم فرزها. تم فرز خلايا مباشرة في استخراج الحمض النووي الريبي العازلة (QIAGEN) ، وتنقيته من الحمض النووي الريبي والتحقق من النقاء والنزاهة وتركيز على Bioanalyzer 2100 (اجيلنت). ثلاث نسخ متماثلة لكلا الخطين تظهر علامة.

<ol>
	<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li><li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots.">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li><li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity.">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li><li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+fluorescent+selection+permits+precise,+rapid,+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts.">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li><li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis.">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li></ol>

يمكن Protoplasts من حيث المبدأ ، يمكن أن تستمد من مجموعة متنوعة من الأنسجة النباتية ، وتحسين الظروف المواتية سوف يعزز كثيرا نوعية وكمية الحمض النووي الريبي. سيكون كل من حل protoplasting وحضانة الانتخابية العازلة المستخدمة تؤثر على هذا الجانب. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>250 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-250/50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-100/47</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-10k</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytatrays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal Medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S5-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M2933</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1767</td>
<td>10 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>Eclipse 90i microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8041</td>
<td>1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CALBIOCHEM</td>
<td>444203</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2536</td>
<td> 1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>orbital shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LAB-LINE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>conical 15 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Legend RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACSAria</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>20170-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy micro kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAGEN</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>WT-Ovation Pico RNA Amplification System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>3300_12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FL-Ovation cDNA Biotin Module V2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>4200_12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts

عالية الدقة ، الخلية نوع معين من تحليل التعبير الجيني يحسن إلى حد كبير فهم التنظيم التنموية والاستجابة للمؤثرات البيئية في أي كائن متعدد الخلايا. التهجين في الموضع والتصور مراسل الجين يمكن إلى حد محدود يمكن استخدامها لهذه الغاية ولكن لارتفاع القرار الكمي RT - PCR أو الإنتاجية العالية transcriptome على نطاق التحليل عزل الحمض النووي الريبي من أنواع الخلايا معين هو المطلوب. تفكك النسيج الخلوي معربا عن علامة بروتين فلوري في نوع من الخلايا المحددة واللاحقة الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS) يجعل من الممكن لجمع كميات كافية من المواد اللازمة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، [كدنا] توليف / ميكروأري التضخيم والتحليل. مجموعة واسعة من الخلايا نوع محدد خطوط مراسل الفلورسنت يتوفر لمحطة المجتمع البحثي. في هذه الحالة ، يتم استخدام خطوط علامة اثنين من الجذر thaliana Arabidopsis : P SCR : : GFP (endodermis ومركز هادئة) و ف WOX5 : GFP (وسط هادئة). تزرع بأعداد كبيرة (آلاف) من الشتلات hydroponically أو على لوحات أجار وحصادها للحصول على ما يكفي من المواد الجذرية لمزيد من التحليل. ويتحقق الخلوية تفارق من المواد النباتية التي الهضم الأنزيمية للجدار الخلية. هذا الإجراء يجعل من استخدام الأسمولية انفكاك الجبلة التي يسببها ارتفاع والسليلوزات المتاحة تجاريا ، وpectinases hemicellulases للافراج عن protoplasts الى حل. FACS من GFP إيجابية الخلايا يستفيد من التصور الأخضر مقابل الانبعاثات الأطياف الحمراء protoplasts ولع ليزر 488 نانومتر. ويمكن تمييز ايجابي GFP protoplasts التي زادت نسبتهم من الأخضر إلى الأحمر الانبعاثات. عادة يتم فرز Protoplasts مباشرة في استخراج الحمض النووي الريبي العازلة وتخزينها لمزيد من المعالجة في وقت لاحق. وكشفت هذه التقنية لتكون واضحة وقابلة للتنفيذ. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن استخدامه دون صعوبة لعزل أعداد كافية من الخلايا لتحليل transcriptome ، حتى بالنسبة لأنواع الخلايا نادرة جدا (مثل خلايا مركز هادئة). وأخيرا ، أظهرت الإعداد لنمو الشتلات Arabidopsis المعاملة غير معقدة تمكن من النباتات قبل الفرز الخلية (على سبيل المثال لنوع محدد من الخلايا تحليل استجابات التوتر الحيوية أو غير الحيوية). تكميلي محتمل يستخدم لمراقبة الأصول الميدانية من محطة protoplasts تمت مناقشتها.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts at JoVE.com

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تسهل علاج<em&gt; thaliana Arabidopsis</em&gt; الشتلات قبل الفرز الخلية.

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

fluorescence-activated-cell-sorting-of-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

24.6K Views.  New York University. ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تس...

Video: Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

تحليل سريع من الظواهر الإيقاعية في نبات الأرابيدوبسيس جبلة مجردة Transfected مع ساعة مراسل الفلورسنت

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...